منابع تحقیق با موضوع تهيه، ميکروليتر، ميليليتر، ديونيزه

گرديد.
به منظور تجزيه واريانس از نرم افزار MSTATC و همچنين از نرم افزار SPSS v.21 استفاده شد.
2-4- آزمايشات الکتروفورز دو بعدي
الکتروفورز دوبعدي در چند مرحله صورت گرفت:
1) تهيه ژل بعد اول (IEF)، 2) استخراج پروتئين، 3) حل کردن پروتئين، 4) الکتروفورز بعد اول، 5) تهيه ژل بعد دوم(SDS-PAGE)، 6) الکتروفورز بعد دوم، 7) رنگ آميزي، 8) تصوير برداري و تجزيه کمي لکههاي پروتئيني

2-4-1- تهيه ژل بعد اول (IEF)
براي تهيه ژل بعد اول، از لولههايي به طول 11 سانتيمتر و قطر سه ميليمتر استفاده شد. انتهاي لولهها توسط پارافيلم مسدود گرديد و طرف ديگر از انتها دو سانتيمتر علامت زده شد تا سطح بالايي ژل در آن مشخص شود. براي تهيه دو ژل لولهاي، با توجه به جدول 2-2، 2/1 گرم اوره توزين شد و داخل بشر ريخته شد سپس، 710 ميکروليتر آب ديونيزه (ddH2O)، 290 ميکروليتر پليآکريلاميد 30% و 500 ميکروليتر40-NP به آن اضافه شد. براي بهتر حل شدن مواد، بشر در آب با دماي کمتر از ?60 قرار داده شد. پس از حل شدن اوره بطور کامل، آمفولينهاي با (10-3)pH و (8-5)pH و سپس 40%10 APS به مقدار 75/3 ميکروليتر و 5/2 ميکروليتر 41TEMED به محلول اضافه و بشر به آرامي تکان داده شد. بدليل شروع واکنش پليمريزاسيون، محلول به سرعت توسط سرنگ شيشهاي به لولهها تا خط نشانه منتقل گرديد. روي محلول 20 ميکروليتر آب ديونيزه اضافه شد تا در مجاورت با هوا قرار نگرفته و واکنش پليمريزاسيون ژل آغاز شود. سرنگ بلافاصله شسته شد تا براي استفاده مجدد آماده شود. مدت زمان يک ساعت براي بستن ژلها در حالت معمول کافي است ولي با توجه به اينکه ژلهاي تهيه شده، 5/3% ميباشند، مدت زمان 5-4 ساعت جهت پليمريزاسيون مطلوب است.

جدول 2-2- مواد و مقادير لازم براي تهيه ژل بعد اول
ترتيب
مواد
مقادير لازم براي تهيه يک ژل
1
اوره
600 ميليليتر
2
آب
355 ميکروليتر
3
NP-40
250 ميکروليتر
4
آکريلآميد استوک 30%
145 ميکروليتر
5
آمفولين (8-5pH )
25/31 ميکروليتر
6
آمفولين (10-3 pH)
25/31 ميکروليتر
7
%10 APS
75/3 ميکروليتر
2-4-2- استخراج پروتئين42
جهت استخراج پروتئين، محلول شماره يک شامل 5 ميليليتر (100%)TCA43، 45 ميليليتر استون سرد و 70 ميکروليتر 2-مرکاپتواتانول44 تهيه شد. 5/0 گرم از بافت ريشه توسط ازت مايع داخل هاون چيني خرد شده و سپس 25/0 گرم از آن به داخل تيوپ ml2 منتقل و در 900 ميکروليتر محلول شماره يک هموژن گرديد. عصاره حاصل به مدت 30 ثانيه ورتکس و سپس درون دستگاه اولتراسونيک داراي يخ خرد شده تيوپ ها به مدت پنج تا ده دقيقه نگهداري شدند. در مرحله بعد، تيوپ ها به مدت يک ساعت در دماي ?20- قرار داده شده و هر 15 دقيقه به مدت 30 ثانيه ( تا يک دقيقه) بطور کامل ورتکس شد. سانتريفوژ در دماي ? 4، با دور g9000 و به مدت 20 دقيقه انجام و با حذف روشناور45، 1500 ميکروليتر از محلول شماره دو، متشکل از 50 ميليليتر استون و 70 ميکروليتر 2- مرکاپتواتانول، بر روي رسوب ريخته شده و کاملا ورتکس گرديد. پس از آن نمونه به مدت يک ساعت در دماي ?20- قرار گرفت. بعد از اين مرحله، مجددا سانتريفوژ در دماي ?4، با دور g9000 و به مدت 15 دقيقه انجام شد. سپس روشناور حذف و 1500 ميليليتر از محلول شماره دو اضافه و پس از ورتکس به مدت 30 تا 40 ثانيه، مجددا سانتريفوژ با شرايط قبلي تکرار گرديد. اين مرحله جهت شستشو 3 بار ديگر تا بي رنگ شدن رسوب پروتئيني46 تکرار شد. در نهايت پس از شفاف شدن روشناور، با حذف آن رسوب پروتئيني در داخل هاون چيني خشک شد.
2-4-3- حل کردن پروتئين
رسوب بدست آمده در اين مرحله به داخل تيوپml 2 منتقل و 230 ميکروليتر بافر ليز47 (جدول 2-3) به آن اضافه و به مدت پنج دقيقه توسط ميله شيشهاي48 و با روش مکانيکي همگن شد. براي اطمينان به مدت دو دقيقه نيز ورتکس انجام گرفت. سپس سانتريفوژ در دماي ?25 با دور g20000 به مدت 20 دقيقه انجام شد و پس از انتقال روشناور به داخل تيوپ ml 5/1 مجدداً سانتريفوژ تکرار گرديد.
در انتها 100 ميکروليتر از روشناور جهت بارگذاري در لولههاي بعد اول به کار رفت. پس از سپري شدن مدت زمان لازم براي بستن ژل بعد اول، پارافيلم انتهاي لولهها برداشته و آب روي آنها با استفاده از دستمال کاغذي خشک شد. لولهها به دستگاه بعد اول متصل گرديد. لولهها طوري سوار شدند که مماس با مخزن پاييني بوده و انتهاي لولهها حداکثر دو ميليمتر با کف مخزن فاصله داشته باشند. در قسمت پايين دستگاه بعد اول محلول اسيد فسفريک (H3PO4) با غظت 02/0 نرمال ريخته شد بطوريکه نيمي از مخزن را پر نمايد. سپس 100 ميکروليتر از محلول پروتئين بدست آمده در هر کدام از لولهها بارگذاري شد. پس از آن 30 ميکروليتر بافر ليز، با نصف غلظت بافر اصلي (30:30، آب : بافر ليز) جهت ممانعت از تماس محلول پروتئين با NaOH، بر روي عصاره پروتئيني اضافه گرديد. سپس NaOH تا حد سر ريز شدن به لولهها اضافه شد. فضاهاي خالي دستگاه در مخزن بالايي توسط سر سمپلر يک ميليليتري مسدود گرديد و تا نصف مخزن بالايي NaOH پر گرديد. در انتها دستگاه به منبع برق متصل شد و الکتروفورز بعد اول طي سه مرحله به ترتيب اجرا گرديد: 200 ولت به مدت نيم ساعت، 400 ولت به مدت 16 ساعت و 600 ولت به مدت يک ساعت (شکل 2-3).
جدول 2-3- مواد لازم جهت تهيه بافر ليز
مواد مورد استفاده
مقدار
اوره49
5/1 گرم
تيواوره50
9/1 گرم
آمفولين51 (10-3 pH)
1/0 ميليليتر
چَپس52
5/0 گرم
X100 Triton
1/0 گرم ( 100ميکروليتر)

شکل 2-3- دستگاه الکتروفورز بعد اول جهت جداسازي پروتئينها بر اساس نقطه ايزوالکتريک
2-4-4
– تهيه ژل بعد دوم (SDS-PAGE)
ژل بعد دوم به صورت دو قسمتي شامل ژل تفکيکي53 و ژل تجمعي54، تهيه شد. ابتدا شيشههاي مخصوص بعد دوم دو و نيم سانتيمتر از محل زاويه 45 درجه شيشه برش يافته، علامتگذاري و با استفاده از کشهاي سيليکوني و گيره به يکديگر متصل شدند. ژل تفکيک کننده مطابق با جدول 2-4 تهيه گرديد. اين مقادير براي دو ژل دو برابر شدند. مواد داخل بشر ريخته شد و پس از اضافه کردن%10 APS و TEMED بشر را کمي تکان داده و محلول حاصل تا خط نشانه در هر کدام از شيشهها ريخته شد و بلافاصله يک ميليليتر آب ديونيزه روي ژلها اضافه شد تا در معرض اکسيژن قرار نگيرد. پليمريزاسيون حدود 45-30 دقيقه طول کشيد. در فاصله بستن ژل جداکننده، ژلهايIEF با استفاده از سرنگ شيشهاي و توسط فشار آب ديونيزه از لولههاي شيشهاي خارج شده و توسط پنس درون شيشههاي دربدار مخصوص بصورت جداگانه براي هر نمونه قرار داده شدند و روي آنها حدودا 15 ميليليتر SDS sample buffer ريخته شد. شيشهها بعد از بستن درب آنها بصورت افقي به مدت 15 دقيقه با سرعت متوسط شيک شدند. پس از سپري شدن 15 دقيقه، SDS sample buffer را تعويض کرده و مجددا بافر جديد ريخته و به مدت 15 دقيقه شيک شد. در اين مرحله ژل تجمعي مطابق جدول 2-5 تهيه گرديد. قبل از اضافه کردن %10 APS و TEMED، آب روي ژلها توسط دستمال کاغذي گرفته شد و محلول ژل تا لبه شيشههاي الکتروفورز ريخته شد. زمان مورد نياز براي پليمريزاسيون 10-5 دقيقه در نظر گرفته شد. در اين مدت ژل آگارز يک درصد با قرار دادن روي هيتر ذوب شد. حال ژلهاي بعد اول آماده بارگذاري بودند. براي اين کار ابتدا مقداري آگارز مذاب روي ژل نگهدارنده ريخته شده و سپس ژل بعد اول به آرامي از درون ظرف شيشهاي خارج و با استفاده از صفحه پلاستيکي روي ژل تجمعي بعد دوم قرار داده شد و با استفاده از آگارز مذاب به ژل تجمعي متصل شد. بعد از تثبيت ژل بعد اول روي ژل بعد دوم، گيرهها و کش سيليکوني از شيشهها جدا و روي دستگاه الکتروفورز بعد دوم قرار داده شدند. شيشهها طوري در دو طرف دستگاه قرار داده شد که هم سطح با کنارههاي دستگاه بوده و ژلها به سمت داخل و روبروي هم قرار گيرند. شيشهها توسط گيره به بدنه دستگاه متصل شدند. پس از آن مخزن پاييني دستگاه تا نصف و فضاي بين دو ژل نيز تا سطح بالاي ژل، توسط بافر رانش55SDS-PAGE پر گرديد. به ازاي هر ژل 200 ميکروليتر (براي دو ژل 400 ميکروليتر) نشانگر آبي بروموفنول56 داخل بافر ريخته شد تا ميزان حرکت جهت کنترل رسيدن اولين (سبکترين) لکه پروتئيني به انتهاي ژل و توقف عمليات رهگيري شود ( شکل 2-4). عمليات رانش با جريان ثابت 35 ميليآمپر براي هر ژل و مدت زمان حدود 3-5/2 ساعت تا رسيدن نشانگر آبي به انتهاي ژل جداکننده برقرار گرديد.
جدول 2-4- مواد لازم براي تهيه ژل تفکيک کننده
ترتيب
مواد
مقادير لازم براي تهيه يک ژل
1
آکريلآميد براي ژل جداکننده57
5/8 ميليليتر
2
بافر ژل جداکننده58 (8/8 pH)
3/6 ميليليتر
3
آب ديونيزه
2 ميليليتر
4
%10 APS
120ميکروليتر
5
TEMED
20 ميکروليتر

جدول 2-5- مواد لازم براي تهيه ژل تجمعي
ترتيب
مواد
مقادير لازم براي تهيه يک ژل
1
آکريلآميد براي ژل نگهدارنده59
1 ميليليتر
2
بافر ژل نگهدارنده60
3 ميليليتر
3
آب ديونيزه
2 ميليليتر
4
APS 10%
30 ميکروليتر
5
TEMED
20 ميکروليتر

شکل 2-4- دستگاه الکتروفورز بعد دوم جهت جداسازي لکههاي پروتئيني بر اساس وزن مولکولي

2-4-5- رنگآميزي
جهت رنگآميزي ژلها از روش نيتراتنقره استفاده شد (سليس و همکاران، 2006) براي اين منظور ابتدا محلولهاي مورد نياز به شرح زير تهيه گرديد:
محلول تثبيت61
براي تهيه يک ليتر محلول ثابت کننده طبق جدول 2-6، 120 ميلي ليتر استيک اسيد گلاسيال را با 500 ميليليتر متانول 96% و نيز 500 ميکروليتر فرمالدهيد 35% مخلوط کرده و با آب ديونيزه به حجم رسانده شد. اين محلول در دماي اتاق قابل نگهداري است.
جدول 2-6- مواد مورد نياز براي تهيه محلول ثابت کننده
مواد
مقادير لازم
متانول
50%
استيک اسيد
12%
فرمالين
آب
05/0%
به حجم يک ليتر رسانده شود

محلول شستشو62
جهت تهيه اين محلول به متانول 20% نياز است. براي تهيه يک ليتر محلول شستشو، 200 ميليليتر اتانول 96% با 800 ميليليتر آب ديونيزه مخلوط گرديد. اين محلول در دماي اتاق قابل نگهداري است.
محلول حساس کننده63
براي تهيه يک ليتر از اين محلول، 200 ميليگرم سديم تيوسولفات آنهيدرات ((Na_2 S_2 O_3) 02/0% ) را با مقدار کمي آب ديونيزه خوب مخلوط و به حجم رسانده شد. اين محلول نيز در دماي اتاق قابل نگهداري است.
محلول رنگآميزي64
براي تهيه يک ليتر از اين محلول طبق جدول 2-7، 2 گرم نيتراتنقره در مقدار بسيار کمي آب ديونيزه حل کرده و پس از افزودن 760 ميکروليتر فرمالدهيد 35% با آب ديونيزه به حجم نهايي رسانده شد. اين محلول بايد به صورت روزانه تهيه و قبل از استفاده مدتي در دماي 4 درجه سانتيگراد قرار داده شود تا خنک شود.
جدول 2-7- مواد مورد نياز جهت تهيه محلول رنگآميزي
مواد
مقادير لازم
نيترات نقره (AgNO_3)
02/0%
فرمالين
آب
076/0%
به حجم يک ليتر رسانده شود

محلول توسعه دهنده65
براي تهيه يک ليتر از اين محلول طبق جدول 2-8، 60 گرم کربنات سديم را در مقدار کمي آب ديونيزه حل گرديده، سپس 4 ميليگرم تيوسولفات سديم آنهيدرات نيز در مقدار کمي آب حل و هر دو محلول با هم مخلوط گرديد، سپس 500 ميکروليتر فرمالدهيد 35% به
آن افزوده و به حجم يک ليتر رسانده شد. اين محلول در دماي اتاق قابل نگهداري است.
جدول 2-8- مواد مورد نياز جهت تهيه محلول توسعه دهنده
مواد
مقادير لازم
کربنات سديم (Na_2 CO_3)
6%
تيوسولفات سديم (Na_2 S_2 O_3)
0004/0 گرم
فرمالين
آب
05/0%
به حجم يک ليتر رسانده شود

محلول خاتمه دهنده66
براي تهيه يک ليتر از محلول خاتمه دهنده، 120 ميليليتر استيک اسيد گلاسيال در 500 ميليليتر آب ديونيزه حل شده و به حجم نهايي رسانده شد. اين محلول در دماي اتاق قابل نگهداري است.
پس از تهيه محلولها مراحل رنگآميزي به شرح زير دنبال شد:
بعد از اتمام الکتروفورز بعد دوم، شيشهها به آرامي توسط لبه کاردک از هم جدا شده و پس از برداشتن شيشه رويي، ژل با احتياط از گوشههاي شيشه جدا شد. ژل تجمعي توسط کاردک حذف و ژل تفکيکي درون ظروف حاوي محلول تثبيت کننده به مدت دو ساعت قرار داده شد.
محلول تثبيت کننده را دور ريخته و ژلها به مدت 20 دقيقه در محلول شسشتو قرار داده شدند. هر 7 دقيقه يکبار و در مجموع 3 بار محلول شستشو تعويض گرديد.
محلول شستشو را از روي ژل ها خالي کرده و محلول حساس کننده در ظرف حاوي ژلها ريخته شد. ژلها به مدت دو دقيقه در اين محلول باقي ماندند. در اين مرحله حساسيت جهت رنگ پذيري افزايش مييابد.
محلول حساس کننده را دور ريخته و ژلها دو مرتبه با آب ديونيزه شسته شدند. به اين ترتيب که هر بار ژلها به مدت يک دقيقه در آب ديونيزه غوطهور سپس آب ديونيزه تعويض گرديد. در پايان آب ديونيزه دور ريخته شد.
محلول رنگآميزي نقره درون ظرف ريخته شد و به مدت 20 دقيقه روي شيکر قرار گرفت. دقت گرديد که محلول رنگآميزي مستقيما بر روي ژل ريخته نشود زيرا باعث ايجاد نتايج غير يکسان در پس زمينه ژل مي شود.
پس از تکميل مرحله رنگآميزي، ژلها با مقداري آب ديونيزه دو بار و هر بار به مدت 20 تا 60 ثانيه شستشو داده شد و سپس آب ديونيزه دور ريخته شد.
به مقدار 300 ميلي ليتر محلول توسعه دهنده به هر ژل اضافه گرديد تا ژلها به مدت 2 تا 5 دقيقه در اين محلول باقي بمانند. به محض اينکه لکههاي پروتئيني ظاهر شدند مرحله توسعه دهندگي متوقف گرديد.
جهت متوقف ساختن مرحله توسعه دهنده و به محض رويت لکههاي پروتئيني، 50 ميليليتر محلول پايان دهنده روي هر ژل ريخته شد. در اين لحظه درون ظرف حبابهايي ايجاد ميشود که با پايان يافتن ايجاد حبابها، اين مرحله نيز پايان يافته است.
2-4-6- تصوير برداري و تجزيه کمي لکههاي پروتئيني
جهت انتقال تصاوير ژلها به کامپيوتر، دستگاه اسکنرBIO-RAD GS-800 بکار رفت. براي جلوگيري از چسبيدن ژل به سطح صفحه اسکنر، صفحه آن با آب مقطر مرطوب و پس از انتخاب نوع ژل دو بعدي و روش رنگآميزي (نيتراتنقره) در نرمافزار مربوطه عمل تصوير برداري انجام گرديد. فايل تصوير برداري شده با پسوند TIFF ذخيره شد تا فراخواني آن براي تجزيه لکههاي پروتئيني امکان پذير باشد. کليه تصاوير ژل به همراه تکرارهاي مربوطه توسط نرمافزار PDQuest مورد بازخواني قرار گرفتند. با مشخص نمودن کمرنگترين، قويترين و کوچکترين لکه بر روي ژلها،

دیدگاهتان را بنویسید