منابع تحقیق با موضوع گندم و برنج

علامت، تنظيم متابوليسم، دفاع در برابر تنش اکسيداتيو، کنترل کانالهاي يوني و تاخوردن پروتئينها دخيل هستند (جوزف و جيني، 2010).
ساکيب و همکاران (2006) نشان دادند که شوري اثر دو مرحلهاي در رشد گياه دارد: ايجاد تغييرات اسمزي که در اثر نمک موجود در آب حاصل ميشود، و يونهاي سمي که در اثر تعرق و افزايش نمک در برگ پديد ميآيد. اين محققين واکنش ارقام مقاوم و حساس به شوري را در گندم مورد بررسي قرار دادند. تغيير بيان پروتئوم، 30 روز پس از قرار گرفتن در معرض 125 ميليمولار کلريدسديم در اتاق کشت ارزيابي شد. همبستگي منفي و معنيداري (99/0-=r2) بين تحمل به نمک و غلظت سديم ساقه در ارقام گندم مورد مطالعه مشاهده گرديد. بيان پروتئينهاي ارقام متحمل و حساس پس از 10 روز تيمار با 125 ميليمولار کلريدسديم، بيش از 5% تغيير کرد اما تفاوت بين ارقام در گروههاي مختلف تغييرات پروتئيني (افزايش بيان، کاهش بيان، ناپديد شدن و ظاهر شدن) از 1 تا 8% متغير بود. ملکي و همکاران (1390) گياهچههاي گندم، رقم متحمل روشن، را به مدت 17 روز تحت تأثير شوري 200 ميليمولار قرار دادند. به منظور مقايسه تغييرات پروفايل پروتئيني برگ بين تيمار شوري و شاهد از روش پروتئوميک در محدوده pH برابر 4-7 استفاده گرديد. تعداد 200 لکه پروتئيني به طور تکرارپذير در ژلها شناسايي و مورد تجزيه آماري قرار گرفت. تعداد 23 لکه با استفاده از طيفسنج جرمي MALDI-TOF-TOF شناسايي شدند. از بين اين لکهها، چهار لکه کاهش بيان و 19 لکه افزايش بيان داشتند. از جمله پروتئينهايي که بيان آنها افزايش يافت، گلوتامين سنتتاز، آسکوربات پراکسيداز، سوپراکسيد ديسموتاز، رابيسکو اکتيواز، و از جمله پروتئينهايي که بيان آنها کاهش يافت، فروکتوز بيس فسفات آلدولاز و پروتئين OEE229 بودند. سانگ (2007) براي درک بهتر توسعه ريشههاي گندم، يک نقشه مرجع از پروتئينهاي محلول در ريشه آن با استفاده از ترکيبي از MS/MS و MALDI TOF MS و 2-DE تهيه نمود. در مجموع 450 لکه پروتئين با رنگآميزي نقره در محدوده pH برابر 4-7 مشاهده و 240 پروتئين مشخص شناسايي شد. اين پروتئينها به دستههاي گوناگون عملکردي تقسيم شدند و در مقايسه با پروتئوم ريشه گندم شاهد، پروتئينهاي دخيل در سوختوساز و حملونقل بيش از حد بيان شده بودند. تعداد 25 پروتئين از 45 پروتئين با بيان متفاوت در متابوليسم، توليد انرژي، رشد و تقسيم سلولي، بيماري، دفاع و متابوليتهاي ثانويه دخيل بودند. آنها همچنين نشان دادند که هيبريداسيون بين دو لاين والديني مي تواند باعث تفاوت بيان پروتئينها در ميان نتاج نسبت به والدين خود ميگردد. جائو و همکاران (2011) تجزيه پروتئوم برگ را با اعمال تنش شوري روي دو رقم گندم متفاوت از لحاظ عملکرد، مقاومت و کيفيت گلوتن بررسي نمودند. گياهچهها با چهار غلظت نمک مختلف (1، 5/1، 2و 5/2 %) ارزيابي شدند. کل پروتئين از برگ گياهان تحت تنش و بدون تنش استخراج و توسط الکتروفورز دو بعدي جدا سازي گرديد. از 2358 لکه پروتئيني، 125 لکه تغييرات قابل توجهي در پاسخ به تنش شوري نشان دادند. با استفاده از طيف سنجي جرمي، 52 لکه در پاسخ به نمک شناسايي شد که در شش گروه عملکردي قرار گرفتند. اين گروهها شامل پروتئينهاي مرتبط با انتقال، آنزيمهاي سمزدايي، ATP سنتتاز، متابوليسم کربن، تشکيل ساختار پروتئين و پروتئينهاي با عملکرد بيولوژيکي ناشناخته بودند. از اين 52 لکه، 26 لکه افزايش بيان، 21 لکه کاهش بيان و پنج لکه الگوهاي چند بياني نشان دادند. داتا و همکاران (2009) اثرتنش شوري در سطوح صفر تا 150 ميليمولار کلريدسديم را روي پنج رقم گندم (HD-2045, RAJ-4123, RAJ-4101, HD-2689, HOW-234) مورد بررسي قرار دادند. نتايج نشان داد که شوري بيشتر از 125 ميلي مولار، در رشد ريشه و ارتفاع بوته کاهش معني داري ايجاد کرده و وزن تر و خشک ريشه و بوته را کاهش مي دهد. حداکثر ميزان جوانه زني در رقم HD-2689 در تمام تيمارها و حداکثر مهارشدگي در رقم HOW-234 در سطوح شوري 150 ميليمولار مشاهده شد. با توجه به تجزيه و تحليل بيوشيميايي، مقدار پرولين با افزايش سطح شوري افزايش يافت و محتواي پروتئين موجود در برگ در تمامي ارقام ذکر شده کاهش نشان داد.
فاتحي و همکاران (2012) از تکنيک پروتئوميک به منظور شناسايي پروتئينهاي پاسخ دهنده به تنش شوري در جو استفاده نمودند. براي بررسي اثر تنش شوري طولاني مدت، بذور در گلخانه کشت و اعمال تنش روي گياهان در مرحله چهار برگي، با سطوح صفر و 300 ميلي مولار NaCl صورت گرفت. نمونه گيري با جدا کردن برگ چهارم هر بوته، 21 روز پس از اعمال تنش انجام شد. نتايج حاصل از اين آزمايش نشان داد که از ميان بيش از 500 لکه پروتئيني تکرارپذير، تعداد 124 لکه داراي تفاوت معنيداري بين تيمارها بودند. پروتئين هاي شناسايي شده در مکانيسمهاي فتوسنتز، کاهش تنش اکسايشي، ترجمه، ترارساني پيام و پروتئين دخيل بودند. ويتزل و همکاران (2009) به منظور شناسايي سازوکارهاي مولکولي تحمل تنش شوري در گياه جو، دو رقم Steptoe و Morex را در سيستم آبکشت بررسي نمودند. پروتئوم ريشه آنها به روش الکتروفورز دو بعدي مورد مطالعه قرار گرفت. طيف سنجي جرمي، موفق به شناسايي 26 لکه از 39 لکه مورد مطالعه گرديد. نشان داده شد که دو پروتئين درگير در سم زدايي ROS در رقم مقاوم فراواني بيشتري دارند ولي پروتئينهاي درگير در جذب آهن در سطح بالاتري در رقم حساس ديده شدند. رسولنيا و همکاران (2011) تغييرات پروتئيني حاصل از تنش شوري را در جو (Hordeum vulgaris L.) متحمل و حساس به شوري بررسي کردند. اعمال تنش شوري در مرحله گياهچهاي صورت گرفت. از تعداد 850 لکه پروتئيني شنا
سايي شده در برگ، تعداد 117 پروتئين تغييرات قابل توجهي به شوري نشان دادند. طيف سنجي جرمي منجر به شناسايي برخي از اين پروتئينها گرديد. پروتئينهايي که امکان سازگاري گياه به تنش شوري را افزايش دادند شامل افزايش سطح بيان آنتي اکسيدانها، تنظيم مثبت پروتئينهاي درگير در مسير ترارساني، پروتئينهاي دخيل در بيوسنتز، توليد ATP و فتوسنتز بودند.
جيانگ و همکاران (2007) براي درک بهتر پاسخ ريشه آرابيدوپسيس به تنش شوري از تجزيه پروتئوميک مقايسهاي تحت نمک 150 ميليمولار نمک به مدت 6 تا 48 ساعت استفاده کردند. پروتئينهاي ريشه تغييرات فراواني توسط الکتروفورز دو بعدي نشان دادند بطوريکه از حدود 1000 لکه پروتئيني شناسايي شده در هر ژل ، 112 لکه پروتئيني کاهش بيان و 103 لکه، افزايش بيان داشتند.
فايک و همکاران (2006) با تجزيه و تحليل بيوانفورماتيکي30 نشان دادند که پروتئين آرابينوگالاکتان داراي دامنه Fasciclin مانند (FLAs31)، در جانوران و گياهان وجود دارد که اين پروتئين در جانوران مسئول چسبندگي و ارتباط بين سلولها ميباشد. مشخص شد که پروتئينهاي FLAs ويژگيهاي ساختاري مشترکي در غلات و گياه آرابيدوپسيس دارد. حداقل در 70% FLAهاي گندم و برنج پيشبيني شده که دامنه GPI32به غشاي پلاسما متصل ميباشد. جستجوي داده پايگاهها نشان داد که بيشتر ژنهاي رمزگردان اين پروتئين بطور ضعيف در دانهها و ريشهها بيان ميشوند. همچنين ژنهاي رمزگردان اين پروتئين در گندم تحت تنش محيطي به ميزان کم بيان مي شوند. پيشبيني مي شود که دامنه مشابه Fasciclin، تشابه بالايي (70%) با دامنه FAS1 مربوط به Fasciclin I چسبندگي سلولهاي عصبي حشرات داشته باشد.
هسيه و چن (2008) پروتينهاي برگ گندم را توسط سولفات آمونيوم رسوب دادند و تجزيه و تحليل توسط الکتروفورز دو بعدي و طيف سنجي جرمي انجام گرفت. در مجموع 200 پروتئين بر اساس تکرارپذيري انتخاب شدند که 123 پروتئين شناسايي شدند. طبقه بندي اين پروتئينها توسط نرم افزار بر اساس خصوصيات فيزيکوشيميايي، عملکرد بيولوژيکي و نقشهاي سلولي صورت پذيرفت. فقط 6/10% از پروتئينهاي شناسايي شده فاقد عملکرد قابل اثبات بودند.
اهداف پژوهش
تعيين الگوي الکتروفورز دو بعدي دو رقم حساس و متحمل به شوري گندم.
شناسايي احتمالي و تعيين نقش فيزيولوژيکي پروتئين هاي درگير در تنش شوري.

2-1- مواد و روش انجام آزمايش
به منظور بررسي تغييرات الگوي پروتئوم بافت ريشه گندم در پاسخ به تنش کلريد سديم، واکنش دو رقم گندم مورد بررسي قرار گرفت. پروتئينهاي پاسخ دهنده به تنش شوري از طريق الکتروفورز دوبعدي و رهيافت پروتئوميک مورد تجزيه و تحليل قرار گرفتند.
2-1-1- مشخصات محل اجراي آزمايش
اين آزمايش تحت شرايط آزمايشگاهي در اتاقک رشد دانشکده کشاورزي دانشگاه تبريز در سال 1391 اجرا گرديد. تنظيم شرايط رشد اين دستگاه به صورت ذيل بود:
دما: روزانه 25-24 درجه سانتيگراد، شبانه 21-20 درجه سانتيگراد.
نور: 15 ساعت روشنايي، 9 ساعت تاريکي.
رطوبت: 50 الي 60 درصد.
2-1-2- مواد گياهي مورد استفاده
مواد گياهي مورد استفاده براي اين پژوهش شامل دو رقم گندم آرتا و بم بود که براساس مطالعات قبلي به ترتيب به عنوان رقم حساس و مقاوم به تنش کلريد سديم انتخاب شده است (وهابزاده و همکاران، 1388).

2-1-3- روش انجام آزمايش
براي کشت بذور، گلدانهايي به قطر 16 سانتيمتر انتخاب و در انتهاي هر گلدان چهار حفره ريز جهت خروج آب اضافي و جلوگيري از خفگي ريشهها تعبيه گرديد. گلدانها با شن ريز (جهت حذف مواد غذايي) پر شدند. پس از مرطوب کردن شنها، بذور درون آن پخش گرديدند به طوريکه تراکم يکنواختي در توزيع بذور وجود داشته باشد. مقدار کمي آب مقطر روي گلدانها پاشيده شد. آزمايش به صورت طرح کاملا تصادفي و براي هر تيمار سه گلدان به عنوان سه تکرار در نظر گرفته شد. ترکيب تيماري دو رقم و دو سطح تنش، تيمارهاي آزمايش را تشکيل دادند. گلدانها در اتاقک رشد قرار داده شدند و تا زمان رسيدن به مرحله دو برگي هر روز با 50 ميليليتر آب مقطر آبياري شدند (شکل 2-1).

شکل 2-1- گياهان کشت شده در اتاقک رشد
زمانيکه گياهان به مرحله دو برگي رسيدند، تنش شوري از نوع کلريدسديم در دو سطح صفر- به عنوان شاهد- و 250 ميليمولار اعمال گرديد. تنش شوري تا ظهور علائم تنش در اندامهاي هوايي گياهان، به مدت يک هفته ادامه داشت.
2-1-4- برداشت ريشه ها
پس از ظهور علائم تنش در اندامهاي هوايي گياهان، مانند از دست دادن طراوت و شادابي گياهان، پس از حدودا هفت روز از اعمال تنش، نسبت به برداشت ريشهها اقدام گرديد (شکل 2-2). در اين مرحله گياهان دو برگ کامل داشتند. ريشهها يکي يکي از درون گلدانها خارج شدند و با آب مقطر شستشو داده شد تا کاملا عاري از ذرات شن باشد سپس سريعا توسط کاغذ خشککن خشک گرديد و درون فويل آلومينيومي که قبلا مشخصات نمونه بر روي آن ثبت شده بود قرار گرفتند. نمونهها در تانک حاوي ازت مايع به آزمايشگاه منتقل و تا زمان استخراج پروتئين در فريزر با دماي 80- درجه سانتي گراد نگهداري گرديد.

شکل 2-2 گياهان پس از اعمال تنش کلريد سديم

2-2- صفات مورد اندازهگيري
پس از بيرون آوردن ريشهها از خاک و جدا نمودن آنها از اندام هوايي، وزنتر آنها بر حسب ميليگرم توزين شد. سپس آنها را درون پاکتهاي کوچک کاغذي قرار داده و به مدت 48 ساعت در داخل آون در دماي 70 درجه سانتي گراد
قرار گرفتند. سپس وزن خشک آنها بر حسب ميليگرم توزين شد. حجم ريشهها با قراردادن آنها درون استوانه مدرج 10 ميليليتري حاوي 5 ميليليتر آبمقطر، قرائت گرديد. تعداد ريشههاي اصلي هر گياه نيز يادداشت شد. در نهايت طول بلندترين ريشه اصلي هر گياه بر حسب سانتيمتر اندازهگيري گرديد.
ميزان پرولين ريشه به روش بيتس و همکاران (1973) اندازهگيري شد. براي اين منظور ابتدا محلولهاي زير تهيه شدند:
سه گرم پودر سولفوسالسيليک اسيد33 را در آب مقطر حل نموده و به حجم 100 ميلي ليتر رسانده شد (اسيد سولفوسالسيليک 3%). مقدار 25/1 گرم پودر نينهيدرين را در 30 ميليليتر اسيد استيک گلاسيال34 حل کرده و به آن 20 ميليليتر اسيد فسفريک شش مولار اضافه گرديد تا با تکان مداوم و حرارت حل شود (اسيد نينهيدرين35). مقدار 6/117 گرم از اسيد فسفريک به حجم 200 ميليليتر رسانده شد (اسيد فسفريک 6 مولار). جهت تهيه محلولهاي استاندارد پرولين (L-Proline: Mw=115.13 gr)، بصورت جدول 2-1 عمل شد.

جدول2-1- نحوه تهيه محلولهاي استاندارد پرولين
غلظت (?mol?l)
حجم نهايي (ميليليتر)
مقدار پرولين مورد نياز
6400
25
0184208/0 گرم پرولين
100
25
625/390 ميکروليتر از محلول 6400
80
25
20 ميليليتر از محلول 100
60
25
75/18 ميليليتر از محلول 80
50
25
83/20 ميليليتر از محلول 60
40
25
20 ميليليتر از محلول 50
30
25
75/18 ميليليتر از محلول 40
20
25
67/16 ميليليتر از محلول 30
10
25
5/12 ميليليتر از محلول 20
0
25
صفر

پس از تهيه محلولها، حدود 2/0 گرم از نمونه ريشه، پس از انجماد در ازت مايع، در هاون پودر گرديد و در پنج ميليليتر اسيد سولفوساليسيليک سه درصد هموژنيزه و درون فالکون ريخته شد. سپس عصاره حاصل با سرعت 6000 دور در دقيقه به مدت هفت دقيقه و در دماي 20 درجه سانتيگراد سانتريفوژ و فاز مايع جدا شد. اين فاز مايع را ميتوان در دماي چهار درجه سانتيگراد نگهداري کرد. يک ميليليتر از روشناور بدست آمده با همان حجم اسيد نينهيدرين و يک ميليليتر اسيد استيک گلاسيال مخلوط و درون فالکون 15 ميليليتري ريخته شد. سپس نمونهها همراه با محلولهاي استاندارد پرولين (بين صفر تا 100 ميکرومول در ليتر) به مدت يک ساعت در حمام آب 100 درجه سانتيگراد همراه با تکانهاي ملايم قرار گرفتند. سپس اجازه داده شد تا نمونهها در حمام يخ به مدت پنج دقيقه خنک شوند. به نمونهها و همچنين محلولهاي استاندارد، دو ميليليتر تولوئن اضافه شد. محلولها به مدت 30 ثانيه تکان داده شده و سپس به مدت 30 دقيقه به حالت سکون رها شدند تا فاز قرمز رنگي در بالاي لوله تشکيل شود. از اين فاز حدود 1000 ميکروليتر براي اندازهگيري استفاده شد. در اين مرحله دستگاه اسپکتروفتومتر36 توسط تولوئن37 صفر گرديد و سپس استانداردهاي پرولين در طول موج 520 نانومتر قرائت و منحني استاندارد رسم شد. ميزان جذب در نمونههاي گياهي قرائت و اعداد قرائت شده از طريق معادله رگرسيون38، به غلظت پرولين تبديل شد.
2-3- تجزيههاي آماري
تجزيه واريانس ساده براساس طرح کاملا تصادفي39 صورت گرفت. قبل از تجزيه واريانس، فرضهاي نرمال بودن خطاها، يکنواختي واريانسها و افزايشي بودن اثر تيمارها بررسي

دیدگاهتان را بنویسید