تهیه ی استوک گلیسرول از آنها استفاده می کنیم. به منظور تایید نهایی، روی ناقل های استخراج شده نیز واکنش PCR تکرار شد و پس از تایید وکتور های حاصل برای واکنش توالی یابی آماده شدند.
جدول۲.۱۸.مواد مورد نیاز برای PCR
مقدار(?l)
نوع ترکیب
۰.۵
F primer
۰.۵
R primer
۱۰
Master mix
۹
Distilled water
۱ colony
DNA Template
۲۰
Total volum
جدول ۲.۱۹.برنامه ی زمانی و دمایی واکنش کلنی PCR
مرحله
زمان(time)
دما(?)
Lid

۱۰۵
Primary denaturation
۵
۹۴
Denaturation
۲۰
۹۸
Annealing
۱
۵۷
Extension
۳۰
۷۲
Repeat for 30 time


Final extension
۱۰
۷۲
Hold

۴
۲-۱۹- تعیین توالی ژن rice-nsLTP2
پس از استخراج ناقل و بررسی ویژگی های کلی آن مانند اندازه و خلوص بر روی ژل، به منظور بررسی عدم وجود جهش در ساختار ژن همسانه سازی شده، بررسی صحت زیرهمسانه سازی انجام شده و اطمینان از صحت قالب خواندن ، مقداری از پلاسمید pET26b نوترکیب استخراج شده برای تعیین توالی به شرکت پیشگامان انتقال ژن ارسال شد.
۲-۲۰-مطالعات بیوانفورماتیکی
۲-۲۰-۱-نرم افزار ها و سرورهای مورد استفاده
نرم افزار ها و سرورهای مورد استفاده جهت بررسی های بیوانفورماتیکی در جدول۲.۲۰ آورده شده است.
جدول۲.۲۰نرم افزار ها و سرورهای مورد استفاده
پایگاه اینترنتی
نام نرم افزار یا سرور
www.expasy.org
Expasy
www.molegro.com
MVD
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast
NCBI BLAST
www.expasy.ch/motif scan
Motif scan
imed.med.ucm.es/tools/antigenic.pl//
Antigenic Prediction
www.cbs.dtu.dk
Hydrophobicity Prediction
imtech.res.in/raghava/b cepreb_submission.html
Antigenic Prediction
imtech.res.in/raghava/propred
Antigenic Prediction
Expasy.org/protscal
Hydrophobicity Prediction
۲-۲۰-۲-بررسی توالی nsLTP2
بررسی وترجمه ی توالی نوکلئوتیدی nsLTP2 برنج ایرانی با استفاده از ابزار های موجود در پایگاه بیولوژی ملکولیExpasy ((www.expasy.org که معتبرترین پایگاه اطلاعاتی پروتئینی است انجام گرفت.توالی پروتئینی مورد نظر پس از کپی کردن توالی نوکلئوتیدی nsLTP2 در قسمت Tranlate Tools این پایگاه بدست آمد،همچنین برای بررسی ویژگی های توالی پروتئینی از قسمت prot param tools در این پایگاه استفاده شد. بررسی ومقایسه ی توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی nsLTP2 برنج ایرانی با سایر توالی های nsLTP2 شناخته شده و یافتن توالی که بیشترین همسانی را با این توالی دارد با استفاده از بخش بلاست پایگاه داده NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast )انجام گرفت.توالی نوکلئوتیدی nsLTP2 برنج گونه ی هندی(Accession no.A2XBN5.2)که دارای ۹۰درصد همسانی با توالی nsLTP2 برنج ایرانی می باشد از قسمت SWISS-PROT پایگاه داده Expasy بدست آمد.
۲-۲۰-۳-بررسی هیدروفوبیسیته یnsLTP2 برنج ایرانی
بررسی میزان هیدروفوبیسیته و همچنین نواحی غشاء گذر nsLTP2 برنج ایرانی با دو روش انجام شد.روش اول TMHMM با استفاده از پایگاه داده((www.cbs.dtu.dk و بر اساس مدلHidden Markov Model نواحی غشاء گذر توالی پروتئینی پیش بینی میشود(Krogh et al.2001).در روش دوم پیش بینی بخش های هیدروفوب با تکنیک Sliding Window و بر اساس روشDoolittle Kyte & با استفاده از پایگاه داده (www.expasy.org/protscale)انجام گرفت.بر اساس روش Doolittle Kyte & برای هیدروفوبیسیته میزانی بین ۶/۴ تا ۶/۴- در نظر گرفته شده است که میزان ۶/۴ بیشترین میزان هیدروفوبیسیته و۶/۴- کمترین میزان هیدروفوبیسیته است در جدول ۲.۲۱ میزان هیدروفوبیسیته برای هر آمینو اسید مشخص شده است.همچنین قبل از پیش بینی بخش های هیدروفوب با این روش باید sliding window size را مشخص کرد که این مقدار تعداد آمینو اسید هایی است که هیدروفوبیسیته ی میانگین دارند(Kyte and Doolittle.1982).
جدول ۲.۲۱. میزان هیدروفوبیسیته ی هر آمینو اسید(Kyte and Doolittle.1982)
Amino Acid Name
Hydropathy Score
Isoleucine
۴.۵
Valine
۴.۲
Leucine
۳.۸
Phenylalanine
۲.۸
Cysteine
۲.۵
Methionine
۱.۹
Alanine
۱.۸
Glycine
-۰.۴
Threonine
-۰.۷
Tryptophan
-۰.۹
Serine
-۰.۸
Tyrosine
-۱.۳
Proline
-۱.۶
Histidine
-۳.۲
Glutamic acid
-۳.۵
Glutamine
-۳.۵
Aspartic acid
-۳.۵
Asparagine
-۳.۵
Lysine
-۳.۹
Arginine
-۴.۵
۲-۲۰-۴-بررسی خاصیت آنتی ژنیسیتی nsLTP2 برنج ایرانی
بررسی خاصیت آنتی ژنیسیتی nsLTP2 برنج ایرانی با کمک پایگاه داده دانشگاه مادرید با آدرس http://imed.med.ucm.es/tools/antigenic.pl انجام شد(Breitender and Mills et al.2005,Edreva.2005,Sarowar et al.2009).در این پایگاه با وارد کردن توالی پروتئینی بخش های آنتی ژنی با استفاده از روش Kolaskar and Tongaonkar تعیین می گردد.در این روش از سه پارامتر میزان دسترسی ، هیدروفوبیسیته وانعطاف پذیری آمینو اسیدهای موجود در یک توالی پروتئینی جهت پیش بینی اپی توپ های سلول های B استفاده می کند.بر اساس این روش باقی مانده های هیدروفوب Val,Cyc,Leu در صورتیکه در سطح پروتئین واقع شده باشند احتمال زیادی هست که بخشی از سایت های آنتی ژنیک باشند(Kolaskar and Tongaonkar.1990).حداقل تعداد اسید آمینه ای که در این پایگاه برای خاصیت آنتی ژنیسیتی بررسی می شود ۸ اسید آمینه است. این روش خاصیت آنتی ژنیک را در پروتئین ها با حدود ۷۵ درصد دقت پیش بینی می کند که این میزان دقت نسبت به سایر روش های موجود بالاتر است.
بررسی های ایمونوژنیسیتی با استفاده از پایگاه داده(http://imtech.res.in/raghava)انجام میشود.در این پایگاه در قسمت (http://imtech.res.in/raghava/propred) اسید آمینه هایی که به صورت اختصاصی به MHC-II سلول های T متصل می شوند نشان داده می شود همچنین در این قسمت سایت های اتصال به آلل DR ژن HLA((HLA-DR پیش بینی می شود((Singh and Raghava.2001.همچنین در قسمت http://imtech.res.in/raghava/bcepreb_submission.html)) بر اساس پارامتر های مختلف اپی توپ های سلول های B را پیش بینی میکند.پارامتر های مورد استفاده در این روش عبارتند از:
قطبیت(Ponnuswamy et al.1980)،انعطاف پذیری(Karplus et al.1985)،هیدروفوبیسیته(Parker et al.1986)و میزان دسترسی (Emini et al.1985)آمینو اسید های موجود در توالی پروتئین مورد نظر.
۲-۲۰-۵-Molecular Docking
Molecular Docking ابزاری کلیدی در بیولوژی ملکولی ساختاری و سیستم های طراحی دارو بر اساس محاسبات کامپیوتری است.مطالعات با استفاده از نرم افزار Molegro انجام شد. در این نرم افزار docking بر اساس یک آلگوریتم هیبرید۱۴ جدید است، که guided differential evolution هم نامیده می شود.این آلگوریتم ترکیبی از تکنیک بهینه سازی تکاملی افتراقی با یک آلگوریتم شناسایی کننده حفره است که به صورت دینامیک در طول docking مورد استفاده قرار می گیرد.آلگوریتم های تکاملی از دسته تکنیک های محاسباتی هستندکه بر پایه ی نظریه ی تکاملی داروین طراحی شده تا بهترین راه کار ممکن را برای حل مسأله ارائه دهند.کاربرد موفق این آلگوریتم را می توان در برنامه ی MolDock مشاهده کرد(Zhao et al.2009).
ساختارهای مورد استفاده در این بررسی دارای فرمت PDB می باشند.خروجی آن Moldock Score که بر اساس بر هم کنش لیگاند .پروتئین محاسبه می شود با واحد kcal/mol بوده که هر چه این میزان منفی تر باشد تمایل اتصال بهتر است.همچنین H bond بالاتر نشان دهنده ی پیوند هیدروژنی بهتر است که بین لیگاند وپروتئین ایجاد می شود(Thomsen and Christensen et al.2006;Zhao et al.2009).
فصل سوم
نتایج
۳-۱-استخراج ناقل های pET26b و pUC57 با استفاده از کیت
در این مرحله جهت تهیه ی میزان کافی از ناقل های pET26b و pUC57 ،برای انجام واکنش های مراحل بعدی،باکتری های حاوی ناقل های ذکر شده در محیط های جداگانه کشت داده شدند وسپس استخراج ناقل با استفاده از کیت انجام گرفت و محصول استخراج بر روی ژل آگارز % ۱ الکتروفورز گردید. نتایج استخراج ناقل در شکل ۳.۱ آورده شده است.

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید