میگویند. (PAOs)
۲-۱۱- خصوصیات میکروبیولوژی PAOs:
اولین توصیف مهم مورفولوژیکی از PAOs توسط Fuhs & Chen در سال ۱۹۷۵ انجام گرفت که بر اساس مشاهداتشان از لجن غنی شده با PAO بود. این دو دانشمند آن ها را بعنوان میله ای غیر متحرک یا کوکسی که معمولا بصورت خوشه ای وجود دارند و دارای دانه های پلی ? هیروکسی بوتیرات و حاوی گرانول های Neisser در سلول هستند، شرح دادند.
همچنین این دو دانشمند گزارش کردند که گونه های اسینتوباکتر بعنوان میکروارگانیسم های غالب در فرآیند EBPR هستند.در روش های شناسایی مشابه هم، چندین دانشمند دیگر هم گونه های اسینتوباکتر رو گزارش کردند. در فرآیند EBPR فقط آن دسته از باکتری هایی که روی محیط کشت ساخته شده، قابل کشت بودن جداسازی و ایزوله شدند.(Buchan, 1983 ; Lotter, 1985 ; Wentzel et al ; 1986) واکنر و همکارانش در سال ۱۹۹۴ از تکنیک های مولکولی استفاده کردند که نشان دادند روش های کشت کلاسیک برای شناسایی و شمارش باکتری های اسینتوباکتر بشدت انتخابی هستند.همچنین تحقیقات بعدی نشان داد که کشت های ناخالص از اسینتوباکتر بر روی لجن صنعتی، قابلیت حذف فسفات بالا را نشان می دهد. با این شواهد و با استناد به آثار مختلف از دانشمندان دیگر، نتیجه گرفتند که گونه های اسینتوباکتر بعنوان موجودات اصلی فرایند EBPR هستند (Jenkins and Tandoi, 1991 ; van Loosdrecht et al., 1997).
بسیاری از تلاشها برای جداسازی PAOs مسئول EBPR انجام شده، ولی هیچ کدام از آنها موفق نشدند تمام میکروارگانیسم های دخیل در فرایند EBPR را نشان بدهند (.(Cloete and Steyn, 1987.
با وجود مشکلات برای جداسازی میکروارگانیسم های مسئول،استفاده از تکنیک های مولکولی به شناسایی بسیاری از میکروارگانیسم های غالب در لجن، که عملکرد EBPR خوبی از خود نشان داده اند، کمک کرده است. (Mino et al., 1998).
Hesselmann وهمکارانش در سال ۱۹۹۹بعدا این باکتری ها را بعنوان”Candidus Accumlibacter phosphatis” نامید.
مطالعات اخیر به وضوح فراوانی فرآیند EBPR را نشان داده است.همچنین مشخص شده که فراوانی Accumlibacter به مقدار فسفر موجود در لجن وابسته است. بعنوان مثال در ۹۰درصد موارد Accumlibacter موجود در لجن با عملکرد EBPR بسیار عالی گزارش شده است.
مطالعات بیشتر نشان داد که فقط گونه های Accumlibacter حاوی دانه های poly-P نیستند، بلکه دیگر گونه های باکتری ها شامل دانه های poly-P هستند. بعنوان مثال گونه های اسینتوباکتر دارای دانه های poly-P هستند.اما اسینتوباکترها نسبت به Accumlibacter ها قادر به جذب اسیدهای چرب فرار (VFAs) نیستند،جذب (VFAs) از ویژگی های عمده مشاهده شده در بسیاری از فرآیند های EBPR است.این نتایج به نقش چند گانه ی موجودات مسئول در فرآیند EBPR اشاره دارد.
مطالعات و تحقیقات بسیار دیگری در زمینه جداسازی و شناسایی ارگانیسم های محلول کننده و حذف کننده فسفات صورت گرفته است که همگی نشان از موفقیت روشها و تکنیکهای به کار گرفته شده در بررسی های آنها بوده است. اما با توجه به اینکه اطلاعات کمی در خصوص جداسازی باکتری های حذف کننده فسفات از پساب صنعتی و به صورت بومی وجود دارد، نتایج پژوهش در پیش روی نیز
میتواند جالب توجه باشد.
فصـل سوم
مواد و روشها
۳-۱- وسایل مورد استفاده
پلیت یکبار مصرف (شرکت فراز بین)
ترازو (شرکت ElectoronicBalace)
دستگاه pH متر (شرکت Jenway مدل fx-320)
یخچال (شرکت الکترواستیل) و فریزر (شرکت Sumsung)
شیکر لوله (شرکت IKA Vortex Genius3)
شیکر انکوباتور (شرکت Heidolphunimax 1010)
انکوباتور (شرکت پارس طب نوین)
اتوکلاو (شرکت پارس طب نوین)
بنماری (شرکت پارس طب نوین)
هود لامینار کلاس ۲ (شرکت بعثت)
میکروسکوپ (شرکت Nikon Eclipse E100)
اسپکتوفتومتر (شرکت WPA)
سمپلر (شرکت Extragene)
دستگاه الکتروفورز (شرکت Majorscience)
دستگاه ترمالسایکلر (شرکت Peqlab)
دستگاه سانتریفوژ (شرکت Hettich مدل EBA20)
دستگاه میکروفیوژ (مدل Eppendorf)
دستگاه نشانگر ژل (Gelve Ultraviolet Transilluminator)
میکروتیوب (شرکت Extragene)و سرسمپلر (شرکت Extragene) و سایر وسایل آزمایشگاه
۳-۲- مواد مورد استفاده
مواد مصرفی مورد استفاده در جدول ۳-۱ آورده شده است.
جدول ۳-۱ لیست مواد مصرفی
مواد استفاده شده
شرکت سازنده
محیط نوترینت آگار
Merck (Germany)
محیطتری فسفات کلسیم
Merck (Germany)
کیت رنگآمیزی گرم
Labtron (Iran)
محیط سیترات
Merck (Germany)
محیط نوترینت براث
Merck (Germany)
محیط VP_MR
Merck (Germany)
محیطKH2PO4
Merck (Germany)
محیط اوره آگار
Merck (Germany)
محیط نشاسته
Merck (Germany)
محیط نیترات
Merck (Germany)
محیط کازئین
Merck (Germany)
محیط اندول
Merck (Germany)
عصاره ی مخمر
Merck (Germany)
کلرید کلسیم
Merck (Germany)
محیط آگار
Merck (Germany)
EDTA
Merck (Germany)
آنزیم لیزوزیم
شرکت سیناکلون(سیناژن)
SDS
Merck (Germany)
پودر آگارز
شرکت سینا کلون
رنگ ایتیدیوم بروماید
شرکت سینا کلون
loading dye DNA
شرکت سینا کلون
MgCl2
شرکت سینا کلون
SmarTaq DNA polymerase
شرکت سینا کلون
Enzyme Buffer
شرکت سینا کلون
dNTP
شرکت سینا کلون
پرایمر
Sigma (USA)
استات پتاسیم
Merck (Germany)
۳-۳- روش کار
۳-۳-۱- نمونه گیری
برای این منظور، پساب مجموعه کارخانجات صنعتی و مراکز تولیدی فعال واقع در شهرک صنعتی آق قلا در استان گلستان مورد نمونه گیری قرار گرفته شده است. نمونه گیری در چند زمان مختلف انجام شده و از پساب و رسوبات آن گرفته شد و پارامتر های اولیه نظیر شرایط فیزیکی و شیمیایی،pH و درجه حرارت پساب در همان محل اندازه گیری شد. سپس نمونه بدست آمده را با قراردادن در ظرف یخ به سرعت به آزمایشگاه منتقل کرده ومورد بررسی قرار گرفته شد.
۳-۳-۲ غنی سازی و کشت
در این مرحله جهت غنی سازی اولیه پساب، ۹۰ میلی لیتر از نمونه پساب به همراه ۱۰میلی لیتر محلول پتاسیم دی هیدروژن فسفات (KH2PO4) %1، در یک بالن کوچک مخلوط شده و سپس به مدت۲روز در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد برروی شیکر با دور پایین گذاشته تا باکتری ها رشد کنند. پس از آن ۳۰میلی لیتر از این مخلوط را به۳ بالن حاوی ۷۵ میلی لیتر محیط نوترینت براث غنی شده با فسفات انتقال داده و این بار به مدت۵روز بر روی شیکردر ۲۵ درجه قرار داده شد (برقی و همکاران؛ ۱۳۸۹).
پس ازطی این مدت، ازسوسپانسیون مورد نظر یک رقت سریالی از ۱-۱۰ تا ۹-۱۰ با استفاده از سرم فیزیولوژی (%۰.۲) تهیه کرده و بر روی محیط Sepreb با pH نهایی ۲/۷ و حاوی تری فسفات کلسیم به عنوان منبع فسفات نامحلول، کشت خالص داده شد. اجزای تشکیل دهنده محیط کشت در جدول ذکر شده اند. برای جلوگیری از رشد قارچ ها در محیط کشت نیز از آنتی بیوتیک سیکلوهگزامید و به مقدار ۵۰۰ میلی گرم در هر لیتر از محیط کشت استفاده شده است. (تیموری و همکاران؛ ۱۳۸۳).
۳-۳-۳ محیط کشت :Seperb
این محیط یک محیط انتخابی برای جداسازی باکتری های حذف کننده ی فسفات می باشد. ترکیب محیط کشت Sepreb (در ml 1000 آب مقطر) در جدول ۲-۳ آورده شده است.
جدول ۳-۲ لیست مواد محیط کشت
نام ترکیب
مقدار مورد نیاز (بر حسب گرم)
گلوکز
۱۰
عصاره مخمر
۰.۵
کلرید کلسیم
۰.۱
تری فسفات کلسیم
۲.۵
سولفات منیزیم
۰.۲۵
آگار
۱۵
شکل (۳-۱) محیط پایه seperb
محیطها پس از تلقیح، در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد به مدت یک هفته گرمخانه گذاری شده و در هر روز جهت بررسی هاله شفاف ناشی از تجزیه فسفات محیط توسط باکتری های محلول کننده فسفات، مورد بازبینی قرار خواهند گرفت.
شکل(۳-۲) هاله ی ایجاد شده در محیط seperbبر اثر مصرف فسفات
۳-۴- شناسایی
۳-۴-۱- روش بیو شیمیایی
طی ۷ روز کلونیهای مشکوک به فعالیت فسفاتازی، جداسازی و خالص سازی خواهند شد. خالص سازی باکتری ها در محیط نوترینت آگار صورت خواهد گرفت. در ادامه از باکتریها لام تهیه شده و رنگ آمیزی گرم خواهند شد. سپس تست هایی نظیر کاتالاز، اکسیداز، تجزیه گلوکز، تجزیه لاکتوز، تولید و یا عدم تولید اسید، آزمون حرکت، احیای نیترات، تجزیه ژلاتین، تولید اندول، تجزیه نشاسته و دکربوکسیلاسیون اسیدهای آمینه به منظور شناسایی باکتری های مورد مطالعه، به مرحله اجرا در خواهند آمد.
۳-۴-۲- روش مولکولی
پس از خالصسازی کلونیهای محتمل بر فعالیت فسفاتازی با تأیید تستهای بیوشیمیایی اولیه، DNA ژنومی باکتریهای مورد نظر با استفاده از کیتهای استاندارد و محلول های مناسب، استخراج شده و میزان خلوص آن و صحت نمونه استخراجی، با انجام بررسیهای کمی و کیفی توسط اسپکتروفتومتر و الکتروفورز، تعیین خواهد شد.
به منظور شناسایی این باکتری ها، همه این جدایه ها از نظر مورفولوژی کلنی، شکل سلول و واکنش گرم مورد بررسی قرار گرفتند و به دنبال آن آزمون های بیوشیمیایی به منظور شناسایی مقدماتی باکتری ها صورت گرفت.
۳-۴-۳- آزمون های بیو شیمیایی:
به منظور شناسایی مقدماتی آزمون های بیوشیمیایی به شرح زیر روی باکتری های جدا شده انجام شد.
۳-۴-۳-۱- واکنش گرم
ابتدا از کلنی باکتری موردنظر، روی لام گستره ای تهیه کرده و گستره، خشک و سپس فیکس گردید. روی گستره، رنگ کریستال ویوله ریخته وبعد از یک دقیقه رنگ را خالی کرده و لام شسته شد، سپس روی گستره، محلول لوگل ریخته و بعد از گذشت زمان یک دقیقه و تشکیل کمپلکس کریستال ویوله- لوگل، عمل رنگ بری با مخلوط الکل-استون انجام شد. در این مرحله اگر باکتری گرم مثبت باشد کمپلکس کریستال ویوله- لوگل را از دست نمی دهد و بنفش می ماند ولی اگر گرم منفی باشد، کمپلکس را از دست داده و بی رنگ می شود. مرحله بعد معرف رنگی سافرانین را اضافه کرده و بعداز ۳۰ تا ۶۰ ثانیه رنگ را خالی کرده و گستره با آب شسته شد.(Gilbert et al., 1981)
شکل(۳-۳) واکنش گرم جدایه ها
۳-۴-۳-۲- احیای نیترات
برخی از باکتری ها ازنیترات به عنوان پذیرنده الکترون استفاده می کنند، بنابراین نیترات را به نیتریت تبدیل میکنند.این واکنش آنزیمی توسط آنزیم نیتراتاز انجام میشود. این تست جهت بررسی قدرت احیا نیترات در باکتری ها به کار می رود، این محیط که دارای ترکیبات جدول شماره (۳-۳) می باشد، در لوله های آزمایش آماده شدو پس از تلقیح با کشت خالص میکروارگانیسم مورد نظر، به مدت ۱۲ تا ۲۴ ساعت در دمای ۲۷ درجه سلسیوس انکوبه شد. بعد از کشت و قرار

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید