صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و به گونهای طراحی و سنتز شدهاند که دارای توالی نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ? در مولکول DNAی مورد نظر هستند. بنابراین بطور اختصاصی فقط به این مولکولها متصل شوند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل میشود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف همانندسازی و تکثیر میگردد. با اعمال تغییرات دمایی بطور متوالی و
برنامهریزی شده، روند PCR تکرار گردیده و در هر مرحله DNA دو برابر میشود. در مرحله همانند سازی، برای جدا نگهداشتن دو رشتهD NA، باید دمای محلول بالا باشد، بنابر این از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده میشود. اولین آنزیمی که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفت Taq پلیمراز بود که از باکتری ترموس آکواتیکوس۸به دست میآید. امروزه PCR بعنوان یک ابزار مهم در فعالیت های تحقیقاتی و بالینی محسوب میشود( Rabinow, 1996).
۳-۴-۳-۱۳ استخراج DNA
استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت سیناژن با شماره کاتالوگ DN 8115C(شکل ۳-۱۱):
۱-کشت باکتری در محیط LB broth برای ۱۸ تا ۲۴ ساعت.
۲-مقدار ۱۰۰۰ میکرولیتر از نمونه باکتری به داخل میکروتیوب ۵/۱ سی سی انتقال داده شده،در دور rpm 10000 به مدت ۳ دقیقه میکروفیوژ شده، سپس محلول رویی دور ریخته میشود و بعد از آن ۴۰۰ میکرولیتر از بافر لیز به آن اضافه میشود و کاملا مخلوط میشود. در این مرحله نمونه به طور کامل باید یکنواخت شود.
۳- سپس در دور ۱۲۰۰۰ برای ۲ دقیقه میکروفیوژ شده و محلول رویی به تیوپ جدید منتقل و۳۰۰ میکرولیتر محلول رسوبگذاری به محلول رویی اضافه شود و چند بار به منظور مخلوط کردن تکان داده شود.۲۰ دقیقه در دمای منفی ۲۰ درجه سلسیوس قرار داده شده، سپس برای ۵ دقیقه در دور rpm 12000 میکروفیوژ شود.
۴-تیوب را وارونه کرده تا محلول رویی خارج شود و برای ۲ تا ۳ ثانیه بر روی دستمال کاغذی قرار داده تا رطوبت آن گرفته شود.
۵-مقدار ۱ میلیلیتر بافر شستشو به تیوبها اضافه کرده، مخلوط کرده و در دورrpm 10000 به مدت۱ دقیقه میکروفیوژ شود.
۶-محلول رویی را دور ریخته و رسوب به طور کامل خشک شده است.
۷-۵۰ میکرولیتر آب مقطربه تیوب اضافه کرده و به آرامی مخلوط شود.
۸-مواد غیر محلول به وسیله سانتریفیوژ در دور rpm12000 به مدت یک دقیقه جدا می شود. محلول رویی حاوی DNA خالص است. نمونه های ژنومی استخراج شده، تا زمان PCR در داخل فریزر با دمای ۲۰- درجه سلسیوس نگهداری می شود.
شکل ۳-۱۱. کیت استخراج DNA شرکت سیناژن
جدول(۳-۱۲) ترکیبات محیط کشت LB (Luria and Burrous، ۱۹۹۵)
اجزا
مقدار(گرم در لیتر)
پپتون از کازئین
۰/۱۰
عصاره مخمر
۰/۵
کلرید سدیم
۰/۱۰
۳-۴-۳-۱۴- تهیه ژل آگارز
یکی از روش های بررسی کیفیت DNA (استخراج شده از بافت ها و یا محصولات PCR)استفاده از الکتروفورز ژل آگارز است. به این ترتیب می توان از سلامت DNA استخراجی و یا تخریب آن آگاه شد.DNA به خاطر بارهای منفی گروه های فسفاتی اش، زمانی که در ژل آگارز ریخته می شود تحت نیروی الکتریکی دستگاه قرار گرفته و با عبور از بین حفرات موجود در ژل از قطب منفی به سمت مثبت حرکت
می کند. هر چه طول قطعات کوتاهتر باشد، عبور از حفرات سریعتر صورت می گیرد و مسافت بیشتری را در ژل طی میکند. در مقابل قطعات بلندتر به سختی از حفرات عبور کرده و مسافت کمتری را طی
میکنند. الکتروفورز بر اساس روش های پیشنهادی Kolmodin (1997) انجام شد. در صورت سالم بودن نمونههای ژنومی، تک باندهای واضح و روشنی به موازات هر چاهک باید تشکیل شود. اما در صورت تخریب ژنوم حین استخراج، DNA به صورت اسمیر یا هالهای روشن به موازات چاهک مربوطه ظاهر
میشود که نشان دهنده نامطلوب بودن استخراج است. از مهمترین دلایل تشکیل چنین اسمیرهایی، عدم دقت لازم حین استخراج و یا فشار مکانیکی روی نمونه های DNA (ضربه های وارده با سمپلر به رسوب DNA و یا ورتکس شدید) میتواند باشد.
برای حرکت DNA در ژل، از ولتاژ ۹۰-۸۰ ولت استفاده می شود که به ازای هر یک سانتی متر از ژل، به آن ولتاژ ۵ تا ۱۰ ولت داده می شود. غلظت ژل نیز بر اساس طول قطعات DNA در نظر گرفته می شود. برای قطعات ژنومی معمولاً از غلظت ۷/۰ تا ۱ درصد و برای محصولات PCR از ۵/۱ تا ۲ درصد استفاده میشود. برای مشاهده نمونه های DNAی ریخته شده در ژل از رنگ فلوئورسانس اتیدیوم بروماید استفاده میشود که با قرار دادن ژل در دستگاه نمایشگر ژل به کمک نور UV می توان باندهای DNA را مشاهده کرد.
۳-۴-۳-۱۵- روش تهیه ژل آگارز یکدرصد و الکتروفورز نمونه های ژنومی
قبل از از تهیه ژل، سینی مخصوص ژل۹ را آماده کرده و شانه مخصوص در سینی قرار داده میشود. فاصله شانه تا کف سینی معمولاً ۵/۰ تا ۱ میلی متر در نظر گرفته می شود. مقدار ۴/۰ گرم پودر آگارز را در ۴۰میلی لیتر بافر ۱۰T.B.Eحل کرده و روی شعله ملایم حرارت داده تا شفاف شود. حین حرارت دادن مخلوط، آن را هم زده تا پودر آگارز رسوب نکند و نسوزد. بافر T.B.E از تریس، بوریک اسید و EDTA تشکیل شده است.این بافر برای تنظیم pH محیط بکار می رود و غلظت آن در ژل و هم در تانک الکتروفورز باید یکسان باشد تا حین برقراری جریان الکتریکی، تعادل یونی بین یون و بافر تانک ایجاد شده و اختلالی در حرکت نمونه های DNA رخ ندهد.
بعد از شفاف شدن ژل، آن را از روی شعله برداشته و وقتی دمای آن به ۶۰-۵۰ درجه سلسیوس رسید، ۱ میکرولیتر اتیدیوم بروماید به آن اضافه کرده و به صورت ۸ انگلیسی مخلوط شود، سپس مخلوط حاصل را سریعاً به داخل سینی مخصوص ژل منتقل کرده تا ژل در ظرف شکل بگیرد(ریختن ژل در ظرف باید آهسته و یک

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید