دانشگاه مراغه
دانشکده علوم پایه
گروه شیمی
پایان‌نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته شیمی آلی
عنوان:
شناسايي سرطان ریه با استفاده از نانوحسگر زيستي بر پايه‌ی
نانوهيبريد گرافن اكسيد – DNA
استاد راهنما:
دکتر باقر افتخاری سیس
استاد مشاور:
دکتر فرخ کریمی
پژوهشگر:
مریم انوری
دی 93
شکر شایان نثار ایزد منان که توفيق را رفیق راهم ساخت تا اين پايان نامه را به پايان برسانم.
از استاد فاضل و اندیشمند جناب آقای دکترباقرافتخاری سیس به عنوان استاد راهنما که همواره مرا یاری نموده‌اند، کمال تشکر و قدردانی را دارم.
از خانم دکتر مریم زیرک که زحمت داوری این پایان نامه را برعهده گرفتند کمال تشکر و قدر دانی را دارم.
از جناب آقای دکتر فرخ کریمی به خاطر مشاوره‌های ارزشمندشان تشکر می‌کنم.
از نماینده‌ی محترم تحصیلات تکمیلی جناب آقای دکتر مجتبی امینی کمال تشکر را دارم.
از استادان گرانقدر جناب آقای دکتر غلامرضا مهدوی‌نیا، دکتر اسرافیلی، دکتر ایرانیفام، دکتر صادق رستمی‌نیا و دکتر کریم کاکایی تشکر و قدردانی می‌کنم.
از آن دو عزیزی که همواره چراغ روشنی بخش زندگی‌ام هستند پدر و مادرم کمال تشکر و قدر دانی را دارم.
درپایان از همسر عزیزم، که سایبان عشق و آرامش و تکیه‌گاه امن و امید بودنم است تشکر و قدردانی می‌نمایم به پاس محبت و زحمات بی دریغش.

چکیده
امروزه سرطان ریه یکی از شایع‌ترین بیماری‌ها در سراسر جهان محسوب می شود و دارای بالاترین آمار مرگ‌ومیر در بین انواع سرطان است. لذا تشخيص زودهنگام اين بيماري از اهميت ويژه‌اي برخوردار می‌باشد. با توجه به اینکه روش‌هاي متداول براي شناسايي سرطان ريه پرهزینه و زمان‌بر مي‌باشند، ارائه روش‌هاي ارزان‌تر و سريع‌تر مورد توجه ويژه‌اي قرار گرفته است. با پیشرفت چشمگیر فناوری نانو در سال‌های اخیر و توسعه‌ی نانو مواد مختلف، فعاليت‌هايي در اين زمينه صورت گرفته است. مطالعات اخیر نشان می‌دهند که نانوماده‌ی گرافن اکسید به علت داشتن خواص منحصر به فرد، در زمینه‌ی طراحی نانوحسگرهای زیستی برای شناسایی سرطان ریه، پتانسیل بالایی دارد.
در پایان‌نامه‌ی حاضر نانوحسگر زيستي بر پايه‌ی نانوهيبريد گرافن اكسيد-DNA برای شناسایی جهش‌های حذفی عامل سرطان ریه ارائه شده است. در این روش، شناسایی جهش‌ها با استفاده از پروب DNA نشاندار شده با FAM و از طریق طیف‌سنجی فلوئورسانس انجام شده است. همچنین گرافن اکسید با استناد به روش هامر سنتز شده، و با استفاده از طیف‌سنجی‌های FT-IR، UV-Vis و تصویر TEM بررسی و مورد تایید قرار گرفته است.

کلیدواژه: گرافن اکسید، نانوحسگر زیستی، سرطان ریه، DNA، جهش حذفی

فهرست مطالب
عنوانصفحه
فصل اول: مقدمه و بررسی منابع1
1-1- سرطان ریه2
1-1-1- عوامل خطرساز3
1-1-2- تغییرات ژنی عامل سرطان ریه4
1-2- اهمیت شناسایی سرطان ریه5
1-3- روش‌های شناسایی سرطان ریه6
1-3-1- نانوسیم‌های سیلیکا7
1-3-2- نانوذرات طلا10
1-3-3- نانولوله‌های کربنی13
1-3-4- نقاط کوانتومی17
1-4-گرافن21
1-5-گرافن اکسید24
1-6-کاربردهای گرافن اکسید27
1-6-1-کاربرد گرافن اکسید در بیوالکتروشیمی28
1-6-2- کاربردهای پزشکی و زیستی گرافن اکسید29
1-7- هدف از کار پزوهشی حاضر38
فصل دوم: بخش تجربی39
2-1- مواد و دستگاه‌ها40
2-2- تهیه‌ی بافر Tris-HCl42
2-3- سنتز گرافن اکسید42
2-4 آماده‌سازی محلول‌‌ها برای اندازه‌گیری طیف‌ فلوئورسانس43
2-4-1- تهیه‌ی محلول مرحله‌ی اول43
2-4-2- تهیه‌ی محلول مرحله‌ی دوم43
2-4-3- تهیه‌ی محلول‌های مرحله‌ی سوم44
2-4-4- تهیه‌ی محلول مرحله‌ی چهارم44
2-4-5- تهیه‌ی محلول‌های مرحله‌ی پنجم44
2-4-6- تهیه‌ی محلول‌های مرحله‌ی ششم45
فصل سوم: نتایج و بحث46
3-1- تهیه گرافن اکسید از گرافیت47
3-2- بررسی طیف UV-Vis گرافن اکسید48
3-3- تفسیر طیف IR گرافن اکسید49
3-4- بررسی تصویر TEM گرافن اکسید49
3-5- انتخاب بیومارکر سرطان ریه50
3-6- تفسیر طیف‌های نشری53
3-6-1- بررسی طیف فلوئورسانس DNA پروب53
3-6-2- بهینه‌سازی زمان جذب DNA پروب بر سطح GO54
3-6-3- بهینه‌سازی مقدار GO در حضور DNA پروب56
3-6-4- بررسی طیف فلوئورسانس کمپلکس DNA-GO پروب در حضور DNA هدف (DNA سالم)57
3-6-5- بهینه‌سازی زمان هیبرید شدن DNA هدف با DNA پروب در حضور GO58
3-6-6- بررسی تغییرات شدت فلوئورسانس کمپلکس DNA-GO پروب در حضور غلظت‌های مختلف DNA هدف60
3-6-7- بررسی طیف‌ فلوئورسانس DNA-GO پروب در حضور mDNA (DNA جهش‌دار)62
3-7- شناسایی سرطان ریه63
3-8- نتیجه‌گیری65
3-9- پیشنهادات66
منابع67
فهرست اشکال
عنوانصفحه
شکل1-1 تصویر SEM نانو سیم‌های سیلیکا8
شکل1-2 پروتکل استفاده شده در روش حاضر8
شکل1-3 ولتاگرام ثبت شده برای نمونه‌های بدون آنتی ژن (قرمز) و دارای آنتی ژن (سبز)10
شکل1-4 حسگرهای بر پایه‌ی نانوذرات طلا11
شکل1-5 پاسخ حسگرها به نمونه‌های سرطانی و سالم12
شکل1-6 پاسخ حسگرها به چهار تا از بیومارکرهای سرطان ریه در غلظت‌های مختلف و آب13
شکل1-7 نحوه تشکیل نانولوله‌های کربنی از صفحات گرافن14
شکل1-8 نانولوله‌های کربنی تک دیواره (SWCNT)14
شکل1-9 نانولوله‌های کربنی چند دیواره (MWCNT)15
شکل1-10 فرآیند عامل‌دار شدن نانولوله‌های کربنی تک دیواره15
شکل1-11 .a تصویر SEM نانولوله‌های عامل‌دار شده، .bبرش عرضی الکترود ID16
شکل1-12 طرح کلی از دستگاه تست16
شکل1-13 نحوه‌ی تشکیل نانو کامپوزیت‌های Fe3O4/CdSe–CdS/APS18
شکل1-14 نحوه‌ی طراحی حسگر ECL19
شکل1-15 MNP/CdSe–CdS (a (b MNP/CdSe–CdS/APS (c MNP/CdSe–CdS/APS/Au NPs20
شکل1-16 منحنی کالیبراسیون استاندارد برای شناسایی آنتی‌ژن CEA21
شکل1-17 گرافن22
شکل1-18 A. فولرن، B. نانولوله‌های کربنی تک جداره، C. گرافن، D. گرافیت23
شکل1-19 مدل‌های ساختاری پیشنهادی برای GO26
شکل1-20 مدل ساختاری لرف – کلی‌نوسکی27
شکل1-21 اتصال الکتریکی پروتئین‌ها به وسیله‌ی GO در الکتروشیمی.29
شکل1-22 روش تثبیت پپتید بر سطح GO30
شکل1-23 شناسایی کاسپاز3 با استفاده از نانوهيبريد گرافن اكسيد- پپتید31
شکل1-24 نحوه‌ی تشکیل کمپلکس Ab-DNA-AuNP32
شکل1-25 حسگر زیستی بر پایه‌ی GO.32
شکل1-26 نحوه‌ی شناسایی چند DNA هدف33
شکل1-27 طیف فلوئورسانس اسکن همزمان34
شکل1-28 a. طیف فلوئورسانس اسکن همزمان در حضور غلظت‌های مختلف DNAهای هدف، منحنی‌های کالیبراسیون برای تعیین کمی غلظت DNA ویروس‌های b. ایدز c. آبله d. ابولا35
شکل1-29 نحوه‌ی شناسایی DNA با استفاده از GO36
شکل1-30 طیف نشری فلوئورسانس P1 در شرایط مختلف P1 (aدر حضور بافر Tris-HCl37
شکل1-31 طیف نشری فلوئورسانس آپتامر- GO در حضور غلظت‌های مختلف ترومبین38
شکل3-1 تبدیل گرافیت به گرافن‌اکسید47
شکل3-2 طیف UV-Vis گرافن اکسید48
شکل3-3 طیف IRگرافن اکسید49
شکل3-4 تصویر TEM گرافن اکسید50
شکل3-5 ژن‌های بیومارکر رایج در سرطان ریه از نوع NSCLC51
شکل3-6 جهش‌های ژن egfr و فراوانی آن‌ها53
شکل3-7 طیف فلوئورسانس DNA پروب و DNA+GO پروب54
شکل3-8 طیف فلوئورسانس DNA پروب در حضور GO در زمان‌های مختلف55
شکل3-9 نمودار تغییرات شدت فلوئورسانس DNA+GO پروب برحسب زمان56
شکل3-10 طیف فلوئورسانس DNA پروب در حضور حجم‌های مختلف GO (با غلظت mgml-1 1)57
شکل3-11 نمودار تغییرات شدت فلوئورسانس DNA+GO پروب برحسب حجم GO 57
شکل3-12 طیف فلوئورسانس GO+ DNAپروب وDNA هدف +GO+DNA پروب58
شکل3-13 طیف فلوئورسانس DNA-GO پروب در حضور DNA هدف در زمان‌های مختلف59
شکل3-14 نمودار تغییرات شدت فلوئورسانس DNA-GO پروب در حضور DNA هدف برحسب زمان60
شکل3-15 طیف فلوئورسانس DNA-GO پروب در حضور غلظت‌های مختلف DNA هدف61
شکل3-16 نمودار تغییرات شدت فلوئورسانس DNA-GO پروب برحسب غلظت‌ DNA هدف61
شکل3-17 نمودار تغییرات شدت فلوئورسانس DNA-GO پروب برحسب غلظت‌ DNA هدف در غلظت‌های کمتر از 40 پیکومولار62
شکل3-18 طیف فلوئورسانس mDNA +GO+DNA پروب و GO+DNA پروب63
شکل3-19 پاسخ نانوحسگر زیستی به DNA هدف (DNA سالم) و mDNA (DNA جهش‌دار)64
شکل3-20 مقایسه‌ شدت نشر فلوئورسانس DNA-GO پروب در حضور دو DNA (سالم و جهش‌دار)64

فصل اول: مقدمه و بررسی منابع

1-1- سرطان ریه
سرطان يك بيماري ژنتيكي است و در اثر رشد و تقسيم غيرقابل كنترل سلول‌ها در قسمتی از بدن بوجود مي‌آيد كه نتیجه‌ی اثر عوامل محيطي و اختلالات ژنتیكي است. به عبارت دیگر سرطان در اثر يك سري جهش‌هاي متوالي در ژن‌هاي انسان اتفاق مي‌افتد. امروزه بیش از 200 نوع سرطان وجود دارد که یکی از شایع‌ترین نوع آن سرطان ریه است.
سرطان ریه دومین سرطان رایج در بین زنان و مردان است و یکی از قابل‌پیشگیری‌ترین انواع سرطان می‌باشد. بطور کلی دو نوع سرطان ریه وجود دارد:
1) سرطان ریه با سلول‌های کوچک1 (SCLC)
2) سرطان ریه با سلول‌های غیرکوچک2 (NSCLC)
که نحوه‌ی رشد و انتشار هر دو در بدن و نیز روش درمان آن‌ها متفاوت است. انواع سرطان ریه براساس نمای ظاهری سلول‌ها زیر میکروسکوپ طبقه‌بندی می‌شوند. سرطان ریه با سلول‌های غیرکوچک (NSCLC) نیز به سه دسته تقسیم‌بندی می‌شود: 1) سرطان بافت سطحی3، 2) سرطان غدد تراوش‌کننده‌ی مخاط و رگ‌های لنفاوی4 (اپيتليوم غده‌اي) و 3) سرطان ریه با سلول‌های بزرگ5 [1و 2]. در بین افراد مبتلا به این نوع سرطان حدود %90-85 موارد از نوع NSCLC و حدود %15-10 موارد از نوع SCLC می‌باشد.
شایع‌ترین علائم بالینی سرطان ریه شامل سرفه‌ی مداوم و مزمن، درد قفسه‌ی سینه، بی‌اشتهایی، کاهش وزن، خلط خونی، تنگی نفس، عفونت‌هاي تنفسی مثل برونشیت، شروع خس خس سینه و … می‌باشد، که معمولا در مراحل اولیه‌ی بیماری ظاهر نمی‌شود. از این رو آمار مرگ و میر این نوع سرطان بسیار بالا است [3].

1-1-1- عوامل خطرساز
استعمال دخانیات به ویژه مصرف سیگار مهم‌ترین عامل خطرساز براي ايجاد سرطان ريه است [4]، چرا كه تقریبا %90‌ بیماران دارای سرطان ریه سیگاری هستند و خطر ابتلا به سرطان ريه حدود 20 تا 40 برابر در افراد سيگاري بيشتر از افراد غيرسيگاري است. استعمال دخانیات علت اصلی ابتلای تقریبا %79‌ زنان و %90 مردان به سرطان ريه گزارش شده است و نیز %90 مرگ و میر‌های ناشی از سرطان ريه در اثر استعمال دخانیات اتفاق می‌افتد [5].
گاز رادون دومین علت عمده سرطان ریه بعد از استعمال دخانیات است [6]، این گاز رادیواکتیو، بی‌بو، بی‌مزه و بی‌رنگ است و به طور طبیعی از شکستن اورانیوم در خاک‌ها و سنگ‌ها تشکیل می‌شود. طبق آمار، سالیانه مواجهه با این گاز در بیش از 20000 مرگ ناشی از سرطان ریه در ایالات متحده آمریکا دخیل است [7]. سایر مواردی که خطر ابتلا به این نوع سرطان را افزایش مي‌دهند و در محیط کار وجود دارند شامل: هیدروکربن‌های آرماتیک چندحلقه‌ای، آرسنیک، آزبست، کادمیوم، بریلیوم، ترکیبات حاوی نیکل و کروم، اترهای کلرومتیل و … مي‌باشند [4]. همچنین مواردی نظیر آلودگی هوا، پيشينه‌ی خانوادگی ابتلا به سرطان ریه، پرتودرمانی ریه‌ها، رژیم غذایی نامناسب، سن بالا، تغییرات ژنی موروثی و اکتسابی و … از عوامل سرطان ریه می‌باشند.

1-1-2- تغییرات ژنی عامل سرطان ریه
در طی چندین سال اخیر، دانشمندان پیشرفت‌هاي زیادی در شناسایی اثر عوامل خطرساز بر روی تغییرات DNA و ژن‌ها که منجر به سرطانی شدن سلول‌ها مي‌شوند، داشته‌اند. آن‌ها مراحل توليد سرطان‌ها را تعيين كرده‌اند كه چندين ژن جهش‌دار در آن دخالت دارند اين تغييرات ژنتيكي باعث از هم گسيخته شدن نظم طبيعي تقسيم و تمايز سلول‌ها مي‌شود.
سرطان ریه اغلب نتيجه‌ی يكسري تغييرات ژنتيكي شامل فعال شدن پروتوانكوژن‌ها و تبديل آن‌ها به انكوژن‌ها6، و غير فعال شدن ژن‌هاي مهارکننده‌ی تومور7 (TSGs) و … است. پروتوانكوژن‌ها ژن‌هایی هستند که در حالت طبيعي مسئول تنظيم تقسيم و رشد سلول‌ها هستند و در صورتی كه جهش ژنتيكي پيدا كنند انكوژن ناميده مي‌شوند كه بيان ژني آن‌ها بسیار بالاست. و ژن‌های مهارکننده‌ی تومور ژن‌هایی هستند که تقسیم سلولی را کند کرده و زمان مرگ سلول‌ها را تعیین می‌کنند. فقدان ژن‌هاي مهار كننده‌ی ‌توموري باعث تقسيم غيرقابل كنترل سلول‌ها می‌شود.
انکوژن‌هایی که منجر به بیماری‌ سرطان ریه می‌شوند شامل c-myc، kras جهش یافته (درهیچ کدام از موارد سرطان ریه از نوع SCLC مشاهده نمی‌شود ولی در %20-15 موارد سرطان ریه از نوع NSCLC و اکثر موارد اپیتلیوم غده‌ای مشاهده می‌شود)، ژن egfr بیش از حد بیان شده، cyclin D1، BCL2 و … هستند. ژن‌های مهارکننده‌ی تومور (TSGs) درگیر در اکثر موارد سرطان ریه شامل p53 (در %90 موارد سرطان ریه از نوع SCLC و %50 موارد سرطان ریه از نوع NSCLC مشاهده می‌شود)، Rb (در %90 SCLC و %20 NSCLC مشاهده می‌شود)، p16 (در بیش از %50 NSCLC و کمتر از %1 SCLC مشاهده می‌شود) و … هستند. و ژن‌های hTR و hTERTتقریبا در همه‌ی انواع سرطان‌ ریه به صورت یک مکانیسم نامیرایی بیان می‌شوند [8].

1-2- اهمیت شناسایی سرطان ریه
سرطان ریه مهم‌ترین و شایع‌ترین علت مرگ ناشی از سرطان در بین مردان و زنان محسوب می‌شود. مرگ و مير بالاي این نوع سرطان، ناشي از ميزان ابتلاي بالا به بيماري و شانس بقاي پايين براي زنده ماندن است. اخیراً انجمن سرطان آمریکا بیش از 226000 مورد جدید سرطان ریه و بیش از 160000 مورد مرگ ناشی از آن را در آمریکا گزارش کرده است که حدود %27 مرگ‌های ناشی از انواع سرطان را تشکیل می‌دهد. و طبق آمارهای جهانی هر سال بیش از یک میلیون نفر در اثر این نوع سرطان جان خود را از دست می‌دهند [3و 9].
بیش از %80 بیماران سرطان ریه در کمتر از پنج سال از زمان شناسایی بیماری جان خود را از دست می‌دهند [10]، چرا که بیشتر آن‌ها در طی مراحل پیشرفته‌ی بیماری و زمانی که درمان آن چندان امکان‌پذیر نیست، متوجه بیماری می‌شوند از این رو شناسایی زودهنگام سرطان ریه از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است.

1-3- روش‌های شناسایی سرطان ریه
تاکنون در زمینه‌ی پزشکی روش‌های مختلفی برای شناسایی سرطان ریه مورد استفاده قرار گرفته است که از جمله‌ی این روش‌ها می‌توان به عکسبرداری از قفسه‌ی سینه با تابش پرتوی ایکس8، سی‌تی‌اسکن9(CT scan) ، ام‌آرآی10 (MRI)، اسکن استخوان11، برونكوسكوپي12، آزمایش خلط13 و … اشاره کرد [11-13]. با پیشرفت‌های چشمگیر فناوری نانو در سال‌های اخیر و توسعه‌ی نانو مواد مختلف، شناسایی بیومارکر‌های سرطان با دقت و حساسیت بالا فراهم شده است. فناوری نانو روش‌های سریع‌تر، ارزان‌تر، دارای حد آشکارسازی پایین‌تر و آسان‌تری را جهت شناسایی سرطان ریه ارائه کرده است. نانو مواد مورد استفاده در این روش‌ها شامل، نانوسیم‌های سیلیکا14، نانوذرات طلا، نانو لوله‌های کربنی15، نقاط کوانتومی16، نانوذرات مغناطیسی و … می‌باشند [14].
بیومارکر‌ها یا نشانگر‌های زیستی، شاخصی از وضعیت زیستی بیماری هستند که برای تشخیص بیماری به کار می‌روند. همچنین این نشانگر‌ها برای مطالعه‌ی فرآیند‌های سلولی و شناخت یا کنترل توقف یا تغییر فرآیند‌های سلولی در سلول‌های سرطانی مورد استفاده قرار می‌گیرند [14]. نشانگر‌های زیستی می‌توانند پروتئین، DNA جهش‌یافته، RNA، لیپید، کربوهیدرات و مولکول‌های کوچک حاصل از متابولیسم سلولی باشند [15]. جدول 1-1 تعدادی از این بیومارکر‌ها را به عنوان نمونه نشان می‌دهد [14].
جدول 1-1 بیومارکر‌های مورد استفاده در شناسایی سرطان‌های مختلف
بیومارکرنوع سرطانPSA, PSMAپروستاتCEA, NSE ریهCA 19-9, BTAپانکراسNMP22, BTAمثانهCA 15-3, 27, 29, Her-2/neuسینه
1-3-1- نانوسیم‌های سیلیکا
نانوسیم‌های سیلیکا، نانو ساختارهای یک بعدی‌اند که در دو بعد کمتر از صد نانومتر و در یک بعد بیشتر هستند [16]. این نانو ساختارها با استفاده از روش رشد بخار- مایع- جامد17 (VLS) سنتز می‌شوند و در سال‌های اخیر به علت داشتن خواص فیزیکی، نوری و الکترونیکی ویژه، فوتولومینسانس، نسبت سطح به حجم بالا و سازگاری زیستی، بسیار مورد توجه محققان قرار گرفتند. تصویر SEM نانوسیم‌های سیلیکا با قطر میانگین 200 نانومتر در شکل 1-1 آورده شده است [17].

شکل1-1 تصویر SEM نانو سیم‌های سیلیکا

برای شناسایی سرطان ریه با استفاده از نانوسیم‌های سیلیکا، ابتدا به منظور تولید گروه‌های NH2 آزاد، نانوسیم‌های سیلیکا با APTMS18 (3-آمینو‌پروپیل‌تری‌متوکسی‌سیلان) عامل‌دار شده و سپس آنتی‌بادی‌های گیرنده‌ی آنتی‌ژن‌های سرطانی خاص طبق شکل 1-2 بر سطح نانوسیم‌های سیلیکا تثبیت شده است.

شکل1-2 پروتکل استفاده شده در روش حاضر

جهت کنترل اتصال‌های غیراختصاصی، از پروتئین مسدود ‌‌‌کننده استفاده شده است. آنتی‌ژن‌های سرطانی موجود در نمونه‌ی مورد نظر به آنتی‌بادی‌های موجود در سطح نانوسیم‌ها متصل شده، سپس آنتی‌بادی‌های آشکارساز که دارای آنزیم آلکالین فسفاتاز (AP) بودند به آنتی ژن‌های سرطانی متصل شده و این اتصال سبب شده است که تحت تاثیر آنزیم آلکالین‌ فسفاتاز، پارا‌نیترو‌فنیل‌فسفات (PNPP) به پارانیترو‌فنول (PNP) تبدیل شود (شما‌ی 1-1). پارا‌نیترو‌فنول که ترکیبی الکتروفعال است، در واکنش‌های الکتروشیمیایی شرکت کرده و در نهایت با استفاده از تکنیک ولتامتری میزان آنتی‌ژن سرطانی موجود در نمونه مشخص شده است.

شمای1-1 تبدیل آنزیمی PNPP به PNP در حضور آنزیم آلکالین ‌فسفاتاز
نمونه‌ای از ولتاموگرام‌های ثبت شده با استفاده از این روش در شکل 1-3 آورده شده است که در صورت عدم وجود آنتی ژن سرطانی هیچ پیکی در ولتاگرام مشاهده نشده است.

شکل1-3 ولتاگرام ثبت شده برای نمونه‌های بدون آنتی ژن سرطانی (قرمز) و دارای آنتی ژن سرطانی (سبز)
در این روش شناسایی، آنتی‌ژن‌های سرطانی IL-1019 و OPN20 به عنوان بیومارکر سرطان ریه مورد استفاده قرارگرفته‌اند و حد آشکارسازی روش برای نمونه‌های خالص ایده آل کمتر از fgml-1 1 و برای نمونه‌های کلینیکی pgml-1 1 تعیین شده است [18].

1-3-2- نانوذرات طلا
شناسایی سرطان ریه با استفاده از نانو ذرات طلا، طی چند مرحله صورت گرفته است. در مرحله‌ی اول هوای بازدم بیماران سرطانی جمع آوری شده و در مرحله‌ی دوم ترکیبات آلی فرار21 (VOCs) موجود در هوای بازدم بیماران سرطانی که به عنوان بیومارکرهای سرطان ریه در نظر گرفته شده بودند با استفاده از روش‌های خاصی شناسایی شده‌اند.
در مراحل بعد حسگرهایی بر پایه‌ی نانو ذرات طلا طراحی شده‌اند که در این حسگرها، نانو ذرات طلا با ضخامت پنج نانومتر به وسیله‌ی گروه‌های آلی مختلف از جمله دکان‌تیول، 1-بوتان‌تیول، 2-اتیل‌هگزان‌تیول، هگزان‌تیول، 2-‌مرکاپتو‌بنزاکسازول و … عامل‌دار شده‌اند و سپس نانو ذرات طلای عامل‌دار شده بر سطح الکترود‌های ID قرار گرفته‌اند. در شکل1-4 تصویر این حسگرها آورده شده است که در آن تصویر TEM نانوذرات طلای عامل دار شده نشان داده شده است. نانوذرات طلا به صورت نقاط تاریک و گروه‌های آلی اطراف آن‌ها به صورت نقاط روشن ظاهر شده‌اند. نانوذرات فلزی سبب رسانایی الکتریکی می‌شوند و مولکول‌های آلی مکان‌هایی را برای جذب سطحی ترکیبات آلی فرار ایجاد می‌کنند [19].

شکل1-4 حسگرهای بر پایه‌ی نانوذرات طلا

در مراحل نهایی حسگرهای طراحی شده، در یک مدار و در داخل یک محفظه نصب شده‌اند که هوای بازدم به داخل این محفظه هدایت می‌شود، زمانی که حسگرها در معرض هوای بازدم قرار گرفته‌اند سبب تغییر برگشت‌پذیر مقاومت مدار شده‌اند. پاسخ حسگرها به نمونه‌های هوای بازدم بیماران سرطانی و افراد سالم با رسم نمودارهایی نشان داده شده، که نمونه‌ای از این نمودارها در شکل 1-5 آورده شده است. در این نمودارها میزان تغییر مقاومت برای نمونه‌های سالم و نمونه‌های سرطانی متفاوت بوده است که از این طریق شناسایی سرطان امکان‌پذیر می‌شود.
شکل 1-5 پاسخ حسگرهای دارای نانوذرات طلای عامل‌دار شده با 2-مرکاپتوبنزاکسازول (لوزی‌های قرمز) و ترشیو-‌دودکان‌تیول (مثلث‌های مشکی) را نشان می‌دهد که به محض قرارگیری در معرض نمونه‌های هوای بازدم بیماران سرطانی (اشکال توخالی) و افراد سالم (اشکال توپر) افزایش مقاومت نشان داده‌اند که میزان این افزایش مقاومت برای نمونه‌های سرطانی بیشتر بوده‌ است. قابل ذکر است که بخش‌های خاکستری رنگ نمودار، قرار گرفتن حسگرها در خلاء و بخش‌های سبز رنگ قرار گرفتن حسگرها را در معرض نمونه‌ها نشان می‌دهد.

شکل1-5 پاسخ حسگرها به نمونه‌های سرطانی و سالم

از آنجایی که حساسیت حسگرها به بیومارکرهای سرطان ریه در حضور مولکول‌های آب خیلی به ندرت تحت تاثیر قرار می‌گیرد و هوای بازدم افراد دارای تقریبا %80 رطوبت نسبی است، حسگرها از کارایی خوبی برخوردارند. شکل1-6 در تایید این مطلب آورده شده است.

شکل1-6 پاسخ حسگرها به چهار تا از بیومارکرهای سرطان ریه در غلظت‌های مختلف و آب

حد آشکارسازی اکثر حسگرها در این روش در حدود ppb 5-1 تعیین شده است، برای مثال حد‌ آشکارسازی حسگرهای دارای نانوذرات عامل‌دار شده با 2-مرکاپتوبنزاکسازول و 4-متوکسی‌تولوئن‌تیول در حدود ppb 10-2 بدست آمده است [20].

1-3-3- نانولوله‌های کربنی
نانولوله‌های کربنی که برای اولین بار در سال 1991 توسط ایجیما22 کشف شدند، از صفحات گرافن تشکیل شده‌اند که به شکل ساختار لوله‌ای یکپارچه در آمده است. نحوه تشکیل نانولوله‌های کربنی از صفحات گرافن در شکل 1-7 آورده شده است [21]. این نانولوله‌ها از لحاظ ساختاری به دو دسته طبقه‌بندی می‌شوند‌: نانولوله‌های کربنی تک دیواره23 (SWCNTs) و نانولوله‌های کربنی چند دیواره24 (MWCNTs). نانولوله‌های تک دیواره از یک صفحه‌ی گرافن لوله‌ای شکل و نانولوله‌های چند دیواره از چند صفحه‌ی گرافن لوله‌ای شکل به صورت هم‌ مركز تشکیل شده‌اند [22و 23]. شکل 1-8 ساختار نانولوله‌های تک دیواره و شکل 1-9 ساختار نانولوله‌های چند دیواره را نشان می‌دهد [24].

شکل1-7 نحوه تشکیل نانولوله‌های کربنی از صفحات گرافن

نانولوله‌های تک دیواره دارای قطر داخلی 2-1 نانومتر هستند و نانو لوله‌های چند دیواره با قطر داخلی 25-2 نانومتر، دارای فاصله بین لایه‌ای 36/0 نانومتر هستند. همچنین طول این نانوساختار‌های یک بعدی بین یک میکرومتر تا چند صد میکرومتر متفاوت است [25]. نانولوله‌های کربن دارای ویژگی‌های مهمی‌ مانند مساحت سطح بالا، استحکام مکانیکی بالا، وزن کم، ثبات بالاي حرارتي و شيميايي، خواص الکترونیکی ویژه و … می‌باشند و در زمینه‌های بيولوژيکى و پزشکی کاربرد وسیعی دارند [26].

شکل1-8 نانولوله‌های کربنی تک دیواره (SWCNT)

شکل1-9 نانولوله‌های کربنی چند دیواره (MWCNT)
به منظور شناسایی سرطان ریه با استفاده از نانولوله‌های کربنی تک دیواره، نوعی حسگر زیستی طراحی شده است. ابتدا نانولوله‌های کربنی تک دیواره برای افزایش گزینش‌پذیری حسگر زیستی، با استفاده از یک ماده‌ی آلی غیرپلیمری پنتادکان (C15H32) یا تری‌کسان (C23H48) عامل‌دار شده‌اند (شکل 1-10). سپس این نانولوله‌های عامل‌دار شده مطابق قسمت b شکل 1-11 بر سطح الکترودهای ID قرار گرفته‌اند و الکترودهای ID به عنوان حسگر زیستی مطابق شکل 1-12 در دستگاه تست قرار داده شده‌اند.

شکل1-10 فرآیند عامل‌دار شدن نانولوله‌های کربنی تک دیواره
شکل1-11 .a تصویر SEM نانولوله‌های عامل‌دار شده، .bبرش عرضی الکترود ID

شکل1-12 طرح کلی از دستگاه تست

در این روش نیز ترکیبات آلی فرار (VOCs) موجود در هوای بازدم بیماران سرطانی به عنوان بیومارکرهای سرطان ریه در نظر گرفته شده‌اند و از آنجایی که نانولوله‌های کربنی از جذب سطحی بالایی برخوردارند ترکیبات آلی فرار (VOCs) موجود در هوای بازدم بیماران سرطانی را جذب کرده‌ و سبب ایجاد تغییر مقاومت در سیستم شده‌اند. در این روش نیز مشابه روش قبل، پاسخ حسگر‌های زیستی به نمونه‌های هوای بازدم بیماران سرطانی و افراد سالم به صورت نمودارهایی نشان داده شده است. در این نمودارها نیز میزان تغییر مقاومت برای نمونه‌های سالم و نمونه‌های سرطانی متفاوت بوده است که در نتیجه شناسایی سرطان ریه امکان‌پذیر می‌شود. همچنین قابل ذکر است که بررسی‌های انجام گرفته نشان داده‌اند که این حسگرهای زیستی برای ترکیب آلی فرار قطبی 1و2و4-تری‌‌متیل‌بنزن نسبت به ترکیب آلی فرار غیرقطبی دکان دارای حساسیت بیشتری هستند [27].

1-3-4- نقاط کوانتومی
نقاط كوانتومي نانوكريستال‌هاي نيمه هادي با قطر10-2 نانومتر هستند كه بعد از تحريك از خود نور ساطع مي‌كنند. این ساختار‌های صفر بعدی به طور معمول از 100 تا 100000 اتم تشكيل شده‌اند [28و 29] و به دليل ويژگي‌هاي نوري -فيزيكي منحصر به فردي كه دارند در طول دو دهه‌ی گذشته توجه زیادی به خود جلب کرده‌اند. محدوده‌ی تحريك‌پذيري گسترده، طيف نشری با پهنای باریک و تنظيم پذير از محدوده‌ی UV تا IR نزدیک، بازده کوانتومی فوتولومینسانس بالا (%85-60)، درخشندگي بالا و پايداري ويژه در برابر نور از جمله ويژگي‌هاي اين نانو مواد است و سبب کاربرد گسترده‌‌ی آن‌ها در زمینه‌ی پزشکی شده است [30و 31].
برای شناسایی سرطان ریه با استفاده از نقاط کوانتومی، حسگر ECL25 جهت شناسایی آنتی‌ژن كارسينوژن جنيني26 (CEA) به عنوان بیومارکر سرطان ریه طراحی شده که برای این منظور ابتدا نانو کامپوزیت‌های Fe3O4/CdSe–CdS/APS سنتز شده‌اند، به این ترتیب که بر سطح نانو ذرات مغناطیسی Fe3O4، یک لایه‌ی پلی‌آلیل‌آمینوهیدروکلرید (PAH) و سپس نقاط کوانتومی CdSe–CdS قرار داده شده‌اند و در نهایت 3-آمینوپروپیل‌تری‌اتوکسی‌سیلان (APS) یک لایه بر سطح نانو ذرات Fe3O4/CdSe–CdS تشکیل داده است (شکل 1-13). APS به عنوان یک عامل موثر در اتصال به مولکول‌های زیستی است و نیز تثبیت نانو کامپوزیت‌ها را بر سطح الکترود تسهیل می‌کند.

شکل1-13 نحوه‌ی تشکیل نانو کامپوزیت‌های Fe3O4/CdSe–CdS/APS

در مرحله‌ی بعد نوعی الکترود مغناطیسی با تثبیت یک آهن‌ربا در داخل یک الکترود طلا طراحی شده است. نانو کامپوزیت‌های Fe3O4/CdSe–CdS/APS به وسیله‌ی نیروی جاذبه‌ی مغناطیسی بر سطح این الکترود تثبیت شده‌اند و سپس نانوذرات طلا بر روی الکترود انباشته شده‌اند. سرانجام پس از اتصال آنتی‌بادی‌های CEA به نانو ذرات طلا و قرار گرفتن الکترود در بافر فسفات حاوی K2S2O8، از آلبومین سرم گاوی27 (BSA) برای مسدود کردن تمام مکان‌های اتصال غیراختصاصی حسگر استفاده شده است. نحوه‌ی طراحی حسگر ECL در شکل 1-14 آورده شده است.

شکل1-14 نحوه‌ی طراحی حسگر ECL

اساس این روش شناسایی بر پایه‌ی ECL است، ECL نوعی لومینسانس تولید شده در طی واکنش‌های الکتروشیمیایی است یا به عبارت دیگر ECL یک روش تولید نور با استفاده از واکنش‌های الکتروشیمیایی برای تولید گونه‌های واکنش‌پذیر در سطح الکترود است. که مکانیسم احتمالی آن طی روابط 1-1 تا 1-4 آورده شده است:

(1-1) CdSe-CdS + e- → CdSe-CdS-
(1-2) S2O82- + e- → SO42- + SO4-
(1-3) CdSe–CdS- + SO4- → CdSe-CdS* + SO42-
(1-4) CdSe-CdS* → CdSe-CdS + hv

شکل 1-15 اندازه‌گیری شدت پیک‌هایECL در طی مراحل ساخت حسگر را نشان می‌دهد. زمانی که نانو کامپوزیت‌های Fe3O4/CdSe–CdS/APS بر سطح الکترود تثبیت شده‌اند پیک b ثبت شده است که این افزایش شدت پیک به نقش کاتالیزوری APS نسبت داده می‌شود. تثبیت نانو ذرات طلا برسطح الکترود نیز سبب افزایش شدت پیک ECL شده است (پیک c)، زیرا نانو ذرات طلا سبب افزایش سرعت انتقال الکترون در واکنش‌های ECL می‌شوند و در مرحله‌ی آخر پس از تثبیت آنتی‌بادی‌ها بر سطح الکترود، این لایه‌ی پروتئینی از انتقال الکترون و نفوذ واکنشگر S2O82- به سطح الکترود و انجام واکنش ECL جلوگیری کرده و منجر به کاهش شدت پیک ECL شده است (پیک d).

شکل1-15 MNP/CdSe–CdS (a (b MNP/CdSe–CdS/APS (c MNP/CdSe–CdS/APS/Au NPs
و (d MNP/CdSe–CdS/APS/Au NP/Ab

زمانی که نمونه‌های حاوی آنتی‌ژن CEA به وسیله‌ی حسگر ECL مورد بررسی قرار گرفته، شدت پیک ECL با افزایش غلظت آنتی‌ژن CEA به تدریج کاهش یافته است. زیرا با تشکیل کمپلکس ممانعت فضایی افزایش یافته و از انتقال الکترون و K2S2O8 به سطح الکترود در طول واکنش‌ ECL جلوگیری کرده است. شکل 1-16 منحنی کالیبراسیون استاندارد برای شناسایی آنتی‌ژن CEA را نشان می‌دهد که رابطه‌ی خطی بین سیگنال ECL و غلظت CEA، تعیین کمی غلظت CEA را امکان‌پذیر می‌سازد.

شکل1-16 منحنی کالیبراسیون استاندارد برای شناسایی آنتی‌ژن CEA

این روش شناسایی سرطان دارای حساسیت و گزینش‌پذیری بالایی بوده و حد تشخیص آن برابر با fgml-1 32 بوده است. بررسی‌ها نشان می‌دهد که این روش در مقایسه با سایر روش‌ها از جمله روش ESEIA از حد تشخیص پایین‌تری برخوردار می‌باشد. قابل توجه است که این روش مختص شناسایی سرطان ریه نمی‌باشد بلکه برای شناسایی انواع دیگر سرطان نیز کاربرد دارد [32].

1-4-گرافن
گرافن یک صفحه‌ی مسطح دو بعدی (D2) از اتم‌های کربن در یک پیکربندی شش ضلعی می‌باشد که اتم‌ها با هیبرید sp2 به هم متصل شده‌اند [33]. صفحات گرافن با کنار هم قرار گرفتن اتم‏های کربن تشکیل می‏شوند که در یک صفحه گرافن، هر کدام از اتم‌های چهارظرفیتی کربن، با سه پیوند کووالانسی به سه اتم کربن دیگر متصل شده‌ است. این سه پیوند در یک صفحه قرار دارند و زوایای بین آن‏ها با یکدیگر مساوی و برابر با 120 درجه است. شکل 1-17 ساختار گرافن را نشان می‌دهد [34].

شکل1-17 گرافن
در سال ۲۰۰۴، گروهی از فیزیکدانان در دانشگاه منچستر به رهبری آندره گایم28 و کستیا نووسلف29 از یک روش ساده و خیلی متفاوت برای تولید گرافن استفاده کردند و منجر به انقلابی در این زمینه شدند. آن‌ها با استفاده از گرافیت سه بعدی از طریق روش لايه لايه كردن ميكرومكانيكى، یک صفحه‌ی واحد (یک مونولایه از اتم‌ها) آن را تولید کردند این روش سبب تولید آسان کریستال‌های گرافن با کیفیت بالا و در ابعاد بیش از صد میکرومتر شد [35].
گرافن، این نانوماده‌ی دو بعدی (D2) جدیدترین عضو خانواده‌ی مواد کربنی چند بعدی است که شامل فولرن‌ها به عنوان نانومواد صفر بعدی (D0)، نانولوله‌های کربنی تک جداره (SWNT) به عنوان نانومواد یک بعدی (D1) و گرافیت به عنوان یک ماده سه بعدی (D3) می‌باشد (شکل 1-18) [33].

شکل1-18 A. فولرن، B. نانولوله‌های کربنی تک جداره، C. گرافن، D. گرافیت
گرافن يك آلوتروپ دو بعدى كربن (با ضخامت يك اتم) با ساختار صفحه‌اى شبكه‌مانند لانه زنبورى است. اين ماده از لحاظ استحکام جزء قويترين موادى است كه تاكنون شناخته شده است. اين تركيب به عنوان عنصرسازنده بنیادی نانولوله‌هاى كربنى و فولرن‌هاى بزرگ است [36].
ساختار دوبعدی گرافن سبب پیدایش ويژگى‌هاى فیزیکی و شیمیایی منحصر به فردی در آن شده است که از جمله‌ی این ویژگی‌ها می‌توان به مدول يانگ بالا (حدود 1100 گيگاپاسكال)، مقاومت بالا در برابر شكست (125 گيگاپاسكال)، رسانايى حرارتى خوب (حدود W/mK5000)، تحرك‌پذيرى بالاى حاملان بار يا به عبارت ديگر رسانايى الكتريكى بالا (cm2/Vm200000)، مساحت سطحى ويژه‌ى بالا (مقدار محاسبه شده: 2630 متر مربع بر گرم)، قابلیت انتقال نور بالا (حدود %7/97) و پديده‌هاى انتقالى شگفت‌انگيزى همچون اثر كوانتومى ‌هال30 اشاره کرد [37].
در سال‌هاى اخير تحقيقات زيادى براى توسعه‌ى روش‌هاى مختلف توليد گرافن صورت پذيرفته است. امروزه سنتز گرافن با کیفیت بالا از طریق روش‌های مختلف مانند رسوبدهى شيميايى بخار31 (CVD)، رشد همبافته روی سطوح عایق الكتريكى، ايجاد سوسپانسيون‌هاى كلوئيدى و لايه لايه كردن ميكرومكانيكى گرافيت انجام می‌شود. که در بسیاری از موارد روش لایه لایه کردن گرافیت به دلیل سادگی روش، کارایی بالا و هزینه‌ی کم انتخاب می‌شود [37و 38].

1-5-گرافن اکسید
گرافن اکسید (GO)، که یکی از مشتقات گرافن است، از یک لایه‌ی اتمی دو بعدی از اتم‌های کربن دارای هیبریداسیون sp2 با پیکربندی شش ضلعی تشکیل شده است. و در آن اتم‌های کربن با هیبریداسیون sp3 متصل به گروه‌های عاملی اکسیژن‌دار وجود دارد.
رایج‌ترین روش برای لایه لایه کردن گرافیت به منظور تولید گرافن اکسید، استفاده از عوامل اکسنده‌ی قوی است [39]، که در نتیجه‌ی آن، با قرارگیری گروه‌های عاملی اکسیژن‌دار در ساختار گرافیت، گرافیت اکسید بدست می‌آید. فاصله‌ی بین دو لایه در گرافیت از nm335/0 به حدود nm 625/0 در گرافیت اکسید افزایش می‌یابد [40]. گرافیت اکسید اساساً از طریق روش اولتراسونیک، لایه لایه شده و صفحات گرافن اکسید تک لایه (با ابعاد چند صد نانومتر تا چند میکرومتر) را ایجاد می‌کند [41].
تعیین ساختار دقیق گرافن اکسید مشکل است اما بدیهی است که گرافن اکسید، شبکه‌ی آروماتیکی پیوسته‌ی گرافن است که گروه عاملی الکل‌ها، اپوکسیدها، کتون‌ها، آلدهیدها و کربوکسیلیک اسیدها به آن متصل شده است [39].
ساختار شیمیایی دقیق GO سال‌ها مورد بحث و بررسی قرار گرفته است، اما تاکنون به دلایل مختلف مدل ساختاری بی‌ابهامی از آن ارائه نشده است. بسیاری از مدل‌های ساختاری اولیه GO، شبکه‌های منظم متشکل از واحد‌های تکراری مجزا را پیشنهاد کردند. ساختار هافمن32 و هلست33 شامل گروه‌های اپوکسی توزیع‌ یافته در تمام صفحات گرافیتی با فرمول مولکولی خالص C2O بوده و مدل ساختاری راس34 که در سال 1946 ارائه شده است، به جای هیبرید sp2 مدل ساختاری هافمن، ساختار مسطح GO را به ساختاری با هیبریداسیون sp3 تغییر داده است. در این مدل، یک چهارم سیکلوهگزان‌ها دارای اپوکسید در موقعیت یک و سه و دارای گروه هیدروکسیل در موقعیت چهار بوده‌اند. در سال 1969، شولز35 و بوهم36 مدلی را پیشنهاد کردند که در آن گروه‌های اتری و اپوکسیدی حذف شده بود. و پس از آن نیز ناکاجیما37 و ماتسو38 مدل جالب توجهی مبنی بر چهارچوب مشبک مشابه با پلی(دی‌کربن‌مونو‌فلورید) (C2F)n را ارائه دادند. مدل‌های ساختاری پیشنهادی برای GO در شکل 1- 19 آورده شده است [42].

شکل1-19 مدل‌های ساختاری پیشنهادی برای GO
جدیدترین مدل پیشنهادی GO، مدل مشبک را رد کرده و بر ساختار بی‌شکل غیراستکیومتری متمرکز شده است. این مدل که معروف‌ترین مدل ساختاری GOاست توسط لرف39 و کلی‌نوسکی40 در سال 1998 ارائه شده است. شکل 1-20 این مدل ساختاری را نشان می‌دهد [42].

شکل1-20 مدل ساختاری لرف – کلی‌نوسکی

1-6-کاربردهای گرافن اکسید
گرافن و گرافن تغييريافته‌ى شيميايی (CMG) يا به عبارت ديگر مشتقات شيميايى گرافن گزينه‌هاى بسيار مناسبى براى كاربردهاى مختلفى همچون مواد ذخيره‌كننده‌ى انرژى، مواد شبه‌ كاغذ، كامپوزيت‌هاى پليمرى، ابزارهاى بلور مايع41، نوسانگرهاى مكانيكى، حسگرها و کاربردهای بیولوژیکی- پزشکی به شمار مى‌روند [38].
در اصل اهمیت GO به دلیل ساختار فیزیکی و شیمیایی بنیادی آن است که تطبیق‌پذیری شیمیایی فوق‌العاده وخواص فیزیکی غیرعادی آن را سبب می‌شود. تطبیق‌پذیری شیمیایی GO، از گروه‌های عاملی اکسیژن‌دار موجود بر روی ساختار کربنی آن ناشی می‌شود که عامل‌دار شدن نسبتاً آسان با مولکول‌های آلی یا ساختارهای زیستی را از طریق پیوند کووالانسی یا غیرکووالانسی، تحت شرایط ملایم امکان‌پذیر می‌کند. اثرات سازگار ناشی از مجموع ساختارهای تعریف شده در سطح GO و همچنین خواص نوری، مکانیکی و الکترونیکی آن سبب توسعه‌ی ساختارهای هیبرید جدید چندکاره می‌شود که پتانسیل بالایی در درمان سرطان دارد [37].
1-6-1-کاربرد گرافن اکسید در بیوالکتروشیمی
گرافن در بیوالکتروشیمی به طور موفقیت‌آمیزی به کار برده شده است، به علت رسانایی بسیار بالا و خواص سطحی منحصر به فرد مانند ضخامت بسیار کم (به اندازه‌ی یک اتم) و جذب سطحی برگشت‌ناپذیر پروتئین در سطح، یک نانو ماده‌ی مفید در علم نانوالکترونیک است. مواد مبتنی بر گرافن می‌توانند به عنوان یک سطح ایده‌آل برای انطباق پروتئین و تسهیل انتقال الکترون پروتئین مورد استفاده قرار گیرند که طی آن، GO سبب اتصال الکتریکی موثری بین الکترود و مراکز اکسایش- کاهش چندین متالوپروتئین دارای گروه هم42، از جمله سیتوکروم‌سی43، میوگلوبین44و هرس‌رادش‌پراکسیداز45 می‌شود (شکل 1-21). نکته‌ی قابل توجه این است که وقتی پروتئین‌ها جذب سطحی گرافن اکسید می‌شوند فعالیت بیولوژیکی و ساختار منسجم خود را حفظ می‌کنند. این ویژگی کاربرد گسترده‌ی کمپلکس پروتئین- GO را در توسعه‌ی حسگرهای زیستی پیش‌بینی می‌کند [43].

شکل1-21 اتصال الکتریکی پروتئین‌ها به وسیله‌ی GO در الکتروشیمی.

1-6-2- کاربردهای پزشکی و زیستی گرافن اکسید
کاربرد‌های نانو مواد همواره به علت انحلال‌پذیری و پایداری کم آن‌ها در محلول‌های زیستی محدود می‌شود اما GO به علت داشتن گروه‌های آبدوست (COOH) و صفحه‌ی مسطح آبگریز کاربرد وسیعی در زمینه‌های زیستی و پزشکی دارد.
آپوپتوزیس46، مرگ برنامه ریزی شده سلولي است كه در شرايط طبيعي سبب حذف سلول‌هاي پير، آسيب‌ديده، اضافي و مضر در بدن مي‌شود. هرگونه اختلال در روند آپوپتوزیس، منجر به بيماري مي‌شود كه از جمله‌ی این بیماری‌ها می‌توان به سرطان، اختلالات خود‌ ايمني، اختلالات نورودژنراتيو و نارسایی قلبی اشاره کرد. کاسپاز347 به عنوان واسطه‌ی مرکزی برای شروع و گسترش آپوپتوزیس شناسایی شده است. یو48 و همکارانش فعالسازی آن را در سلول‌های زنده با استفاده از نانوهيبريد گرافن اكسيد- پپتید به عنوان یک نانوحسگر پروتئاز درون‌ سلولی شناسایی کردند. پروب پپتید با استفاده از روش جفت شدن هیدروکسی‌سوکسین‌ایمید (EDC-NHS) به GO متصل شده (شکل 1-22) و حلالیت و پایداری بی‌نظیری را در آب و محیط رشد سلولی نشان داده است. طی آزمایشات متعدد در آزمایشگاه حد آشکارسازی ngmL–1 25/7 nM)4/0 (~ برای کاسپاز3 بدست آمده است. نانو هيبريد گرافن‌اكسيد- پپتید به طور موثری به درون سلول‌های HeLa (سلول‌های سرطانی دهانه رحم) هدایت شده و فعالسازی کاسپاز3 که به وسیله‌ی staurosporine (STS) تحریک شده بود، توسط نانوحسگر پروتئاز درون سلولی شناسایی شده است (شکل 1-23) [44].

شکل1-22 روش تثبیت پپتید بر سطح GO

شکل1-23 شناسایی کاسپاز3 با استفاده از نانوهيبريد گرافن اكسيد- پپتید

توسعه‌ی حسگرهای زیستی جدید با حساسیت، گزینش‌پذیری و سرعت بالا در شناسایی عوامل بیماری‌زا، تشخیص‌های پزشکی، غربالگری ایمنی و در جلوگیری از آلودگی محیط زیست از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است.GO به علت داشتن خواص منحصر به فردی مانند تغییر سطح آسان، استحکام بالا، قابلیت دیسپرس شدن خوب در آب و فوتولومینسانس، پتانسیل بالایی برای استفاده در حسگرهای زیستی دارد.
در سال‌های اخیر جانگ49 و همکارانش یک حسگر زیستی بر پایه‌ی GO برای شناسایی روتاویروس به عنوان یک عامل بیماری‌زا گزارش کردند. که در آن GO بر سطح شیشه‌ای اصلاح شده‌ی آمینی رسوب داده شده و آنتی‌بادی روتاویروس از طریق واکنش تشکیل آمید به کمک کربو‌دی‌ایمید، بر سطح GO تثبیت شده است. سپس آنتی‌بادی دوم روتاویروس به وسیله‌ی یک مولکول DNA به عنوان واسطه به نانو ذره‌ی طلا متصل شده است. نحوه‌ی اتصال آنتی‌بادی روتاویروس به نانو ذره‌ی طلا در شکل 1-24 آورده شده است.

شکل1-24 نحوه‌ی تشکیل کمپلکس Ab-DNA-AuNP

زمانی که سلول روتاویروس موجود در نمونه‌ی مورد نظر با برهمکنش ویژه‌ی آنتی‌بادی-آنتی‌ژن به آنتی‌بادی موجود در سطح GO متصل شده است، اتصال سلول هدف با مشاهده‌ی کاهش فلورسانس GO از طریق FERT50 بین GO و نانو ذره‌ی طلای متصل به آنتی‌بادی دوم تایید شده است. به این ترتیب شناسایی عامل بیماری‌زا به وسیله‌ی حسگر زیستی امکان‌پذیر شده است. شکل1-25 این حسگر زیستی را نشان می‌دهد. قابل ذکر است که حدآشکارسازی حسگر زیستی برای روتاویروس pfumL-1105 بوده است [45].

شکل1-25 حسگر زیستی بر پایه‌ی GO.
زو51 و همکارانش اخیراً پروب‌های حاوی رنگ‌های فلورسنت بر پایه‌ی GO را برای شناسایی توالی‌های خاصی از DNA گزارش کردند. آن‌ها سه توالی نوکلوتیدی مربوط به ویروس‌های ایدز52 (HIV)، آبله53 (VV) و ابولا54 (EV) را به ترتیب با استفاده از رنگ‌های آلی Alex Fluor 488، ROX و Cy5 شناسایی کردند که طرح کلی این روش شناسایی حساس چند DNA‌ در شکل 1-26 آورده شده است.

شکل1-26 نحوه‌ی شناسایی چند DNA هدف

در مرحله‌ی اول پروب‌های تک رشته‌ای DNA دارای رنگ‌های آلی بر روی GO جذب سطحی شده، و در مرحله‌ی بعد با افزودن DNA مکمل هر کدام از پروب‌ها (DNAهای هدف (T1, T2, T3، پروب‌ها با DNAهای هدف هیبرید شده و از سطح GO جدا شده‌اند. مرحله‌ی اول با کاهش شدید شدت فلوئورسانس و مرحله‌ی دوم با افزایش شدت فلوئورسانس رنگ‌های آلی همراه بوده است (شکل 1-27).

شکل1-27 طیف فلوئورسانس اسکن همزمان

تحت شرایط بهینه رابطه‌ی بین شدت فلوئورسانس رنگ‌های آلی Alex Fluor 488، ROX و Cy5 و غلظت‌ DNAهای هدف در بافر Tris-HCl بررسی شده است. شکل 1-28 طیف فلوئورسانس اسکن همزمان در حضور غلظت‌های مختلف DNAهای هدف (قسمت a شکل) و نیز رابطه‌ی خطی بین شدت فلوئورسانس رنگ‌های آلی(∆I) و غلظت‌ DNAهای هدف (C) (قسمت‌های b تاd شکل) را نشان می‌دهد که در آن I1∆، I2∆ و I3∆ به ترتیب بیانگر شدت فلوئورسانس رنگ‌های آلی Alex Fluor 488، ROX و Cy5و نیز C1،



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه ارشد

پاسخ دهید