منابع پایان نامه ارشد درمورد گروه کنترل

پایان نامه ها و مقالات

كه سلولها، ظاهري نسبتاً يكدست يكنواخت دارند و بيشتر به شكل دوكي و شبه فيبروبلاستي ديده مي‌شوند .نشانگر زرد: سلولهاي در حال تقسيم، نشانگر آبي: سلولهاي دوکي وفيبروبلاستي شکل و نشانگر قرمز: سلولهايي با مورفولوژي پهن.

شكل 2. شناسايي سلولهاي مزانشيمي مغز استخوان موش صحرايي. A: سلولهاي مزانشيمي مغز استخوان را نشان مي‌دهد كه به آنتي‌بادي CD71 واكنش مثبت نشان داده‌اند، B: ايمونوسيتوشيمي سلولهاي مزانشيمي با روش آلكالين فسفاتاز يك مرحله‌اي، در اين تصوير سيتوپلاسم سلولهايي كه واكنش مثبت به نشانگر آلكالين فسفاتاز نشان داده‌اند، به رنگ صورتي ديده مي‌شود.

شکل 3. تصوير فاز کنتراست از MSCs در پاساژ پنجم بعد از دو هفته. A: بعد از هفته اول، سلولها مورفولوژي دوکي شبه فيبروبلاستي نشان دادند و به سرعت تکثير يافتند، B وC: در هفته دوم سلولها مورفولوژي شبه نوروني نشان دادند و زوائد طويلي از اين سلولها گسترش يافت.

شکل 3. تصوير فاز کنتراست از پاساژ پنجم MSCs پس از هفته سوم. بعد از کشت طولاني مدت بدون پاساژ و تعويض محيط، سلولها از کف فلاسک کشت جدا شده و به صورت تودههاي کروي شبه نوروسفري در سطح محيط کشت شناور شدند (D-F).

شکل4. تأييد هويت سلول‌هاي عصبي با استفاده از روش ايمونوسيتوشيمي. A: سلولهاي مزانشيمي مغز استخوان در هفته دوم کشت به سلولهاي نوروني تمايز پيدا کردند و به نشانگر ?III-tubulin پاسخ مثبت دادند، B: فاز کنتراست تصوير A

شکل 5. تأييد هويت نوروسفرها با استفاده از نشانگر نستين. A: سلولهاي بنيادي مزانشيمي در هفته سوم کشت بدون پاساژ، متراکم شدند و تشکيل ساختار کروي شکل شبه نوروسفري را دادند. تودههاي شبه نوروسفري به نشانگر نستين پاسخ مثبت دادند، B: فاز کنتراست تصوير .A

شكل 6. A الگوي بيان ژن فاکتورهاي نوروتروفيک در پاساژ پنجم سلولهاي بنيادي مزانشيمي (گروه کنترل) و B : گروه آزمايشي (کشت طولاني مدت). 2M ?: ژن بتا-2 ميكروگلوبولين گروه كنترل داخلي ميباشد.
از چپ به راست L: Ladder, NGF: 164bp, NT3: 181bp, NT4/5: 213bp, GDNF: 254bp, ?2M: 318bp, BDNF: 405bp.

شكل 6. C الگوي بيان ژن پيشساز عصبي و ژنهاي اختصاصي سلولهاي دوپامينرژيک در سلولهاي بنيادي در پاساژ پنجم سلولهاي بنيادي مزانشيمي (گروه کنترل) و D: گروه آزمايشي (کشت طولاني مدت). 2M ? : ژن بتا-2 ميكروگلوبولين گروه كنترل داخلي ميباشد.
از چپ به راست L: Ladder, Tyrosine hydroxylase:276 bp, ?2M: 318 bp, Nestin:431 bp, Nurr1:683 bp.

نمودار 6A . مقايسه ميزان بيان نسبي ژنهاي فاکتورهاي نوروتروفيک در گروه آزمايشي و کنترل. اين نمودار شدت باند ژنهاي فاکتورهاي نوروتروفيک را نسبت به ?2M نشان ميدهد. ميزان بيان نسبي NGF و GDNF در گروه آزمايشي نسبت به گروه کنترل و بيان نسبيNT4/5 در گروه کنترل نسبت به گروه آزمايشي افزايش معني داري)05/0(p< داشته است، (n= 5).
نمودار6 B.مقايسه ميزان بيان نسبي ژنهاي نوروني در گروه آزمايشي و کنترل. اين نمودار شدت باند ژنهاي نوروني را نسبت به ?2M نشان ميدهد. ميزان بيان نسبي ژنهاي Nurr1 و Nestin در گروه آزمايشي افزايش معني داري)05/0(p< نسبت به گروه کنترل داشته است، (n= 5). فصل4 بحث و نتيجهگيري
مطالعات گسترده و فزاينده پيرامون سلولهاي بنيادي به منظور درک دقيق ايجاد يک ارگانيسم پيچيده از يک سلول زنده و نيز چگونگي جايگزيني سلولهاي سالم با سلولهاي آسيب ديده در يک موجود بالغ متمرکز ميباشد. اين حوزه از پژوهشهاي هيجان انگيز، به دلايل فراوان پژوهشگران زيادي را به سوي تحقيق در مورد امکان سلول درماني براي درمان شمار زيادي از بيماريهاي مهم انساني مانند بيماريهاي سيستم عصبي مرکزي سوق داده است.
پژوهشگراني مانند Reynold و Weiss وجود سلولهاي پيشساز يا سلولهاي بنيادي را در مغز پستانداران بالغ گزارش دادند و حتي اين سلولها را در شرايط in vitro کشت دادند ]141، 145[. سلولهاي بنيادي عصبي (NSCs) سلولهايي با قابليت خودتکثيري هستند و به سه رده سلولي تشکيل دهنده سيستم عصبي مرکزي، شامل نورون، آستروسيت و اليگودندروسيت تمايز پيدا ميکنند.
يکي از روشهاي کشت سلولهاي بنيادي عصبي، روش کشت سوسپانسيون است]144،154[. در اين روش کشت، ساختارهاي کروي سه بعدي به نام نوروسفر ايجاد ميشود. اين سلولها به صورت سوسپانسيون تک سلولي در محيط حاوي EGFو bFGF به همراه N2/B27 کشت داده ميشوند] 187[. محققين از اين روش کشت به صورت نوروسفر براي نشان دادن ويژگي خود تکثيري و توانايي ايجاد ردههاي سلول عصبي استفاده ميکنند]145[.
به دليل مشکلات اخلاقي در استخراج NSCs از جنين و به علت ذخاير محدود سلولهاي بنيادي در سيستم عصبي مرکزي و حتي محدوديتهايي در استخراج NSCs از بافت مغز بالغ، برخي از پژوهشهاي اخير بر توليد نوروسفر از سلولهاي مزانشيمي مغز استخوان در شرايط مشابه کشت سلولهاي بنيادي عصبي متمرکز شده است. هدف ما از پژوهش حاضر، کشت طولاني مدت سلولهاي مزانشيمي مغز استخوان و توليد سلولهاي پيشساز عصبي (نوروسفر) بدون حضور القاگر يا همراه شدن با سايتوکين و همچنين بررسي بيان ژنهاي فاکتورهاي نوروتروفيک و ژنهاي نوروني در MSCs ميباشد.

4-1 مورفولوژي سلولهاي بنيادي مزانشيمي در کشت طولاني مدت و تاييد هويت آنها

سلولهاي بنيادي مغز استخوان از مورفولوژي غير يکنواختي در محيط کشت برخوردار ه
س
تند به طوريکه مي‌توان سلولها را به سه فرم دوكي كشيده و شبه فيبروبلاستي، مسطح و پهن با زوائد سلولي متعدد، گرد و كوچك و در حال تكثير مشاهده كرد. با پاساژهاي مكرر، از تعداد سلول‌هاي رده خوني كاسته شده و سلول‌هاي مزانشيمي افزوده ميشود. در پاساژ پنجم عمده سلول‌هاي باقي مانده در فلاسك از نوع مزانشيمي بوده و سلولها با مورفولوژي شبه فيبروبلاستي و برخي از سلولها بهصورت پهن و از نظر اندازه بزرگتر از ساير سلولها در محيط کشت ديده ميشدند. گزارشات قبلي نيز نشان ميدهد MSCs در کشت مورفولوژي فيبروبلاستي و دوکي شکل دارند و به ظروف کشت ميچسبند ]4،12،188[. تعدادي از سلولها که ظاهري گرد و کوچک دارند از سرعت خود تکثيري بالايي برخوردارند]189[، و از پاساژ دوم به بعد حذف ميشوند ]103[. در پژوهش حاضر، سلولهاي بنيادي مزانشيمي به مدت سه هفته کشت داده شدند و به بررسي مورفولوژي سلولها در هفتههاي اول، دوم و سوم پرداخته شد. بعد از هفته اول کشت، سلولها با موفولوژي دوکي شبه فيبروبلاستي مشاهده شدند که قادر به خود تکثيري بودند. در هفته دوم، سلولها شروع به تغيير مورفولوژي شبه نوروني کردند و زوائد بلند و ضخيم در اين سلولها مشاهده گرديد. طي هفته سوم، بدون تعويض محيط کشت، تشکيل تودههاي سلولي کروي شکل به هم چسبيده شبيه به نوروسفر را دادند. اين مشاهدات با نتايج Tseng و همکارانش (2006) وLi و همکارانش (2007) در کشت طولاني مدت مطابقت داشت ]168،190[.
ارزيابي آنزيم آلكالين فسفاتاز به روش ايمنوسيتوشيمي نشان داد كه سلول‌هاي جدا شده از مغز استخوان موش صحرايي فعاليت آلكالين فسفاتازي بالايي دارند. ميزان بالاي فعاليت اين آنزيم از ويژگي‌ سلول‌هاي تمايز نيافته مانند سلول‌هاي بنيادي جنيني و كارسينوماي جنيني است ولي با تمايز سلولي، اين فعاليت نيز كاهش مي‌يابد [23]. در اين تحقيق MSCs آنزيم آلکالين فسفاتاز را بيان کردند که نشان دهندهي حالت تمايز نيافته اين سلولهاست.
يكي ديگر از معيارهاي تشخيص MSCs، بيان آنتي‌ژن سطحي CD71 است. مشاهده شدکه حدود 90 درصد از اين سلولها نشانگر CD71 را بيان کردند. Lou و همکارانش نيز نشان دادند که 95 درصد MSCها بهCD71 پاسخ مثبت ميدهند] 49[. بعد از کشت طولاني مدت (سه هفته)، به منظور تاييد هويت سلولهاي پيشساز عصبي يا نوروسفرها از روش ايمنوسيتوشيمي Nestin استفاده شد. نتايج ايمنوسيتوشيمي پژوهش حاضر نشان داد که اين تودههاي سلولي کروي شناور در محيط کشت به نشانگر نستين پاسخ مثبت دادند. اين مشاهدات مطابق با نتايج Tseng و همکارانش است. اين محققين نيز تودههاي سلولي شناور را بعد ازکشت طولاني مشاهده کردند که به نشانگر نستين پاسخ مثبت دادند] 168[. در گزارشات زيادي از Nestin به عنوان نشانگر سلولهاي بنيادي عصبي نام برده شده و مشاهده کردند که بيش از 90 درصد اين سلولها به نستين پاسخ مثبت ميدهند] 49،191 .[

4-2 بيان فاکتورهاي رشد عصبي در کشت سه هفتهاي سلولهاي بنيادي مزانشيمي مغز استخوان

در پژوهش حاضر الگوي بيان فاکتورهاي NGF، BDNF ،GDNF، NT3 و NT4/5 در گروه کنترل ( پاساژ پنجم) و گروه آزمايشي ( کشت سه هفتهاي) بررسي شد و مشاهده گرديد که در هر دو گروه، همهي فاکتورهاي ذکر شده بيان ميگردند. در تحليل آماري شدت بيان ژنها بررسي شد و مشخص گرديد، بين بيان نسبي (نيمه کمي) فاکتورهاي رشد عصبي در گروه آزمايشي و کنترل، NGF و GDNF نسبت به گروه کنترل افزايش معنيداري را نشان ميدهد. تحقيقات اخير هم نشان ميدهد که MSCs قادرند فاکتورهاي نوروتروفيکNGF ، NT3، BDNF و GDNFرا در شرايط کشت بيان کنند ]78.[
Ye و همکارانش بيان فاکتور نوروتروفيک GDNF را در MSCs موش صحرايي مورد بررسي قرار دادند و با استفاده از تکنيک RT-PCR و الايزا مشاهده کردندکه بيان GDNF در MSCs و در محيط کشت بتدريج از 3 تا 10 روز بعد از کشت افزايش مييابد. بنابراين MSCs توانايي ترشح و بيان اين فاکتور را دارا هستند] 103[. Chen و همکارانش نيز گزارش دادند MSCs قادرند در شرايط کشت فاکتورهاي رشد NGF،GDNF ، BDNF و NT3 بيان کنند. افزايش بيان فاکتور NGFتا هفته هفتم کشت با استفاده از تکنيک الايزا تاييد شده است. در حاليکه بيان فاکتورهايGDNF ،BDNF و NT3 بدون تغيير باقي ماند]102[.
نتايج پژوهش حاضر نشان داد که فاکتورهاي نوروتروفيکNGF، BDNF، NT3، NT4 وGDNF در پاساژ پنجم و حتي در کشت طولاني مدت MSCs، بدون حضور القاگر يا تعويض محيط کشت بيان ميشوند و احتمالاترشح فاکتورهاي نوروتروفيک توسط اين سلولها در محيط کشت منجر به بقاي MSCs در طولاني مدت، حتي بدون دريافت مواد غذايي ميشود.
Kashani و همکارانش (2010) بيان فاکتورهاي نوروتروفيکNGF، BDNF ،NT3 ، NT4/5 و GDNF را در MSCsقبل و بعد از القا با داروي سلژيلين، بررسي کردند و مشاهده شد که بيان اين فاک

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *