دادن درانکوباتور به این محیط دو معرف A و B(جدول ۳)اضافه گردید. لازم به ذکر است که در این محیط ها از لوله دورهام استفاده می شود. معرفA حاوی سولفانیلیک اسید و معرفB حاوی دی متیل آلفا نفتیل آمین می باشد در حضور نیتریت، این معرف ها رنگ محیط را قرمز می کنند. یعنی بعد از افزودن معرف ها قرمز شدن محیط نشانه احیای نیترات به نیتریت است و چنانچه درون لوله دورهام حباب گاز تشکیل شده باشد نشان دهنده احیا نیترات به N2
میباشد. که در این حالت افزودن معرفها رنگ محیط را تغییر نمیدهد (Smibert and Krieg, 1981).
جدول(۳-۳). ترکیبات محیط نیترات
مقدار(گرمدر لیتر)
اجزا
۶/۸
پپتون گوشت
۴/۶
کلرور سدیم
۵/۱
نیترات پتاسیم
pHمحیط کشت روی ۱/۰±۲/۷ تنظیم شده است.
جدول (۳-۴). معرف های Aو Bدر محیط نیترات
مقدار(گرم در لیتر)
اجزا
۱۰۰ میلی لیتر
اسید استیک غلیظ
معرف A
۲۵۰ میلی لیتر
آب مقطر
۸/۲ گرم
اسید سولفانیلیک
۱۰۰ میلی لیتر
اسیداستیک غلیظ
معرف B
۲۵۰ میلی لیتر
آب مقطر
۱/۲ گرم
دی متیل آلفا نفتیل آمین
۳-۴-۳-۳- تولید هیدروژن سولفید و توانایی حرکت
مقدار ۳۰ گرم محیط کشت SIM1را در یک لیتر آب مقطر حل کرده، در لولههای آزمایش تقسیم کرده تا ارتفاعی حدود ۴ سانتی متر بدست آید، اتوکلاو کرده، لوله ها را به صورت عمودی نگه داشته تا محتویات داخل آن جامد شوند. محیط تهیه شده شفاف و تا حدودی زرد رنگ است. از کشت خالص هر باکتری به تعداد ۳ تکرار در این محیط به کمک آنس سوزنی تلقیح کرده و ۱۸ تا ۲۴ ساعت در دمای ۲۷ درجه سلسیوس انکوبه شدند. این محیط نیمه جامد یا ژلهای است و حاوی تیوسولفات و سیتراتآهن و تریپتوفاناست که اگر باکتری گاز هیدروژن سولفید تولید کند با تیوسولفات رنگ سیاه تولید میکند. حرکت باکتری بواسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد.
باکتریهای فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است، کدر میکنند.(Hunterand Crecelius,1938)(جدول ۴).
شکل(۳-۴)عدم تولید هیدروژن سولفید و توانایی حرکت
جدول(۳-۵) محیط کشتSIM (Hunter and Crecelius،۱۹۳۸)
مقدار(گرم در لیتر)
اجزا
۰/۲۰
پپتون کازئین
۶۰/۶
پپتون گوشت
۲۰/۰
سیترات آمونیوم آهن(۳ ظرفیتی)
۲۰/۰
تیوسولفات سدیم
۰/۳
آگار-آگار
۳-۴-۳-۴- اکسیداز
این آزمون با روش کواکس (۱۹۵۶) انجام شد.برای انجام آزمون اکسیداز از معرف N..N.N.N- تترا متیل -P- فنیل دی آمین استفاده شد. معرف مورد استفاد تازه تهیه شده و چون در حضور نور اکسید
میشود در شیشههای تیره نگهداری شد. یک کاغذ صافی را روی لام قرار داده و سپس کلنی تازه را روی آن قرار داده و ۲ تا ۳ قطره از معرف اکسیداز به آن اضافه کرده، اگر در کمتر از یک دقیقه (۱۰ ثانیه) رنگ کلنی آبی – بنفش شد نتیجه آزمون مثبت در نظر گرفته می شود.
۳-۴-۳-۵- کاتالاز
اکثر باکتریهای هوازی و بیهوازی آنزیمی به نام کاتالاز دارند که قادر است، ترکیبات سمی نظیر پراکسید هیدروژن را که در اثر متابولیسم و تنفس باکتری ها ایجاد می شود تجزیه کند. برای انجام این آزمون بهتر است از کشت های ۲۴ ساعته استفاده شود.آب اکسیژنه مصرفی نیز باید تازه باشد. یک قطره آب اکسیژنه ۳ درصد را روی لام قرار داده و مقداری از کلنی باکتری را داخل آن فرو برده، در صورتیکه حباب های اکسیژن آزاد شود باکتری کاتالاز مثبت است (Grahamet al., 1964).
شکل(۳-۵)آزمون کاتالاز
۳-۴-۳-۶- سیترات
سیترات به عنوان یک منبع کربن توسط بعضی از باکتریها مصرف میشود. سیمون سیترات۲ محیط جامدی حاوی سیترات سدیم (منبع کربن)،یون های آمونیم (منبع نیتروژن) و معرف بروموتیمول بلواست. این محیط در لوله به صورت شیب دار تهیه می شود و واکنش کاملاً هوازی است. باکتری به کمک آنزیم سیتراتاز، سیترات موجود را به اسیدهای ضعیفی نظیر اسیداستیک و اگزالیک تبدیل نموده که این ها در سیکل کربس مورد مصرف قرار گرفته و CO2 ایجاد می شود. CO2 حاصل با H2O وNa+ موجود در محیط واکنش داده وکربنات سدیم قلیایی ایجاد می کند، این ترکیب محیط را قلیایی کرده و رنگ آن را از سبز به آبی تغییر می دهد. برای بررسی توانایی تولید سیتراتاز توسط باکتری ها مقداری از کلنی باکتری را روی سطح محیط کشت به صورت خطی۳ کشت می دهند و پس از ۲۴-۱۸ ساعت نتیجه را بررسی می نمایند در صورتی که رنگ محیط از سبز به آبی تغییر کند نتیجه آزمون مثبت است (Simmons, 1976).
شکل(۳-۶) آزمون سیترات
جدول(۳-۶) ترکیبات محیط سیمون سیترات (Simmons، ۱۹۷۶)
مقدار (گرم بر لیتر)
اجزا
۰/۱۵
آگار
۰/۵
کلرید سدیم
۰/۲
سیترات سدیم
۰/۱
فسفات پتاسیم
۰/۱
فسفات آمونیوم
۲/۰
سولفات منیزیم ۷ آبه
۰۸/۰
برمو تیمول بلو
pH محیط کشت روی ۲/۰ ±۸/۶ تنظیم شده است.
۳-۴-۳-۷- آزمونOF (Oxidation/Fermentation)
این آزمون جهت تعیین نوع متابولیسم باکتری استفاده میشود. باکتریهای هوازی متابولیسم تنفسی و انواع بیهوازی متابولیسم تخمیری و انواع بیهوازی اختیاری هم تخمیر و هم تنفس را انجام میدهند. معرف این محیط برومو تیمول بلو است که در pH برابر با ۶ به رنگ زرد، و در pH برابر با ۱/۷ به رنگ سبز و در pH برابر با ۶/۷ به رنگ آبی است و چون دامنه تغییرات pH آن بسیار به هم نزدیک است، لذا مقادیر بسیار کم اسید را که در جریان عمل تنفس یا اکسیداسیون ایجاد می شود نشان می دهد. برای این منظور مقداری از کلنی باکتری( ۱۸ تا ۲۴ ساعت رشد کرده) را بوسیله آنس سوزنی به محیط کشت تلقیح می کنیم و بعد از ۴۸-۲۴ ساعت نگهداری در انکوباتور و دمای ۲۸ درجه سلسیوس در صورتی که رنگ محیط زرد شود آزمون را مثبت در نظر می گیریم (Atlas and Parks, 1993).
شکل(۳-۷) آزمون OF
جدول(۳-۷) ترکیبات محیط OF
مقدار (گرم بر لیتر)
اجزا
۰/۵
کلرید سدیم
۰/۲
آگار
۰/۲
پپتون
۳/۰
فسفات پتاسیم
۰۸/۰
برمو تیمول بلو
۰/۱۰۰ میلی لیتر
محلول کربوهیدرات
pHمحیط کشت روی ۱/۰ ±۸/۶ تنظیم شده است.
۳-۴-۳-۸- آزمون MR / VP
برخی از باکتریها قادر به تخمیر مخلوط اسیدی۴ هستندواز تخمیر گلوکز تولید اسید میکنند. اسید حاصل با معرفی مانند متیل رد واکنش می دهد. برخی از باکتری ها دارای چرخه تخمیر بوتاندیول۵
میباشند و از تخمیر گلوکز در مرحله نهایی مادهای به نام استیل متیل کربینول (استوئین)تولید می کنند. این ماده در محیط قلیایی و درحضوراکسیژن به دی استیل تبدیل می شود.دی استیل ایجاد شده دراثر تاثیر کاتالیتیک آلفا نفتول و هیدروکسید پتاسیم ۴۰ درصد به ترکیب قرمز رنگ تبدیل شده که اساس تستvp راتشکیل میشود.
برای انجام این تست از محیط مایع MR / VP استفاده میشود. مقدار پنج سی سی از محیط مایع را در داخل لوله آزمایش ریخته وآن را اتوکلاو میکنیم، سپس باکتری را به آن تلقیح نموده و به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۳۵ درجه سلسیوس انکوبه میکنیم. پس از پایان انکوباسیون، ۵ قطره معرف متیل رد به محیط اضافه شود. تشکیل رنگ قرمز نشان دهنده مثبت بودن تست MR است. برای انجام تست VP به محیط هیدروکسید پتاسیم ۴۰ درصد و آلفا نفتول اضافه کرده و به مدت ۳۰ ثانیه آن را تکان داده و نتیجه را بعد از ۱۵ دقیقه گزارش میکنیم که تشکیل حلقه قرمز در سطح محیط نشان دهنده مثبت بودن آزمون است (Omeara, 1931).
شکل(۳-۸) آزمون MR
جدول(۳-۸) ترکیبات محیط MR / VP براث (Omeara، ۱۹۳۱)
اجزا
مقدار(گرم در لیتر)
پپتون
۰/۷
دکستروز
۰/۷
پتاسیم فسفات
۰/۵
PH محیط کشت روی ۹/۶ تنظیم شده است.
۳-۴-۳-۹- هیدرولیز نشاسته
برخی از باکتری ها قادرند با تولید آنزیم آمیلاز نشاسته را تجزیه کنند. باکتری ها را بر روی محیط نشاسته آگار۶ کشت می دهیم و به مدت ۴۸ ساعت در ۳۷ درجه سلسیوس انکوبه می کنیم. در پایان این مدت روی سطح محیط کشت، محلول لوگل می ریزیم، وجود یک منطقه شفاف و بی رنگ در اطراف کلنی نشان دهنده مثبت بودن تست است. Seeley and Van demark، ۱۹۸۱))
شکل(۳-۹) هیدرولیز نشاسته
جدول(۳-۹) ترکیبات محیط نشاسته آگار (Starch Agar)
مقدار(گرم در لیتر)
اجزا
۰/۵
پپتون
۰/۳
عصاره گوشت گوساله
۰/۲۰
نشاسته
۱۰۰۰ میلی لیتر
آب مقطر
۰/۲۰
آگار
pH محیط کشت روی ۷ تنظیم شده است.
۳-۴-۳-۱۰- هیدرولیز کازئین
برخی از باکتری ها با تولید آنزیم کازئیناز، کازئین موجود در شیر را تجزیه می کنند. باکتری را بر روی محیط Skim Milk Agar به صورت خطی کشت می دهند و در دمای ۳۰ درجه سلسیوس به مدت یک هفته انکوبه می کنند. بعد از پایان انکوباسیون، وجود منطقه شفاف در اطراف کلنی ها در یک زمینه سیاه نشان دهنده مثبت بودن نتیجه آزمون است ((Seeley and Vandemark, 1970.
جدول(۳-۱۰) ترکیبات محیط Skim milk agar (Seeley and Vandemark، ۱۹۷۰)
اجزا
مقدار(گرم در لیتر)
پودر Skim milk
۰/۱۰۰
پپتون
۰/۵
آگار
۰/۱۵
pH محیط کشت روی ۲/۷ تنظیم شده است.
۳-۴-۳-۱۱- تجزیه ژلاتین
توانایی برخی از باکتری ها در تجزیه ژلاتین در تشخیص مهم می باشد. ژلاتین در اثر تجزیه شدن به مایع تبدیل می شود. باکتری ها به دلیل داشتن ژلاتیناز، ژلاتین محیط را تجزیه می کنند. برای انجام ای آزمایش، باکتری را در محیط نوترینت ژلاتین که در لوله است کشت داده و در ۳۰ درجه سلسیوس به مدت ۲۴ ساعت انکوبه می کنیم و بعد از ۲۴ ساعت، به مدت ۳۰ دقیقه دریخچال در دمای ۴ درجه سلسیوس می گذاریم، بعد از این مدت اگر محیط به حالت مایع باشد، نتیجه آزمون مثبت و اگر جامد شده باشد جواب منفی است (Blazevic and Ederer, 1975).
شکل(۳-۱۰) آزمون تجزیه ژلاتین
جدول(۳-۱۱) ترکیبات محیط نوترینت ژلاتین (Blazevic and Ederer، ۱۹۷۵)
مقدار(گرم در لیتر)
اجزا
۰/۵
پپتون
۰/۳
عصاره گوشت گوساله
۰/۱۲۰
ژلاتین
۱۰۰۰ میلی لیتر
آب مقطر
pH محیط کشت روی ۸/۶ تنظیم شده است.
۳-۴-۳-۱۲- شناسایی مولکولی جدایه ها با استفاده از تکنیک PCR7
در بیولوژی مولکولی، واکنش زنجیره ای پلی مراز یا PCR، به منظور تکثیر یک قطعه DNA مورد استفاده قرار میگیرد. تکنیک PCR در سال ???? توسط کری مولیس (Kary Mullis) ارائه شده است. در این تکنیک، یک مولکول DNA میلیون ها بار تکثیر می شود. در روش PCR سیکل های دمایی (Cycle) ایجاد
میشود. در ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن دمای محلول به نقطه ذوب DNA، دو رشته DNA از هم جدا
میشوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده، عمل همانندسازی را انجام
میدهد. DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانی DNA)، رشته الگو (DNAی مورد مطالعه) و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است.

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید